尚德志，張麗艷，汲坤，沈薇，牟均

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室；3.國資處，沈陽11003 4）

電壓門控鉀通道（Kv）由電壓感受器（S1-S4）和孔道區(qū)域（S5-P-S6）組成。傳統(tǒng)的電壓門控機制Shaker模型建立在大量電生理數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上，認為S3-S4是跨膜片段，S4因帶有大量電荷，位于由S1-S3片段及相鄰亞單位的S5組成的水性環(huán)境中間［1］。隨著古細菌電壓門控KvAP蛋白X-ray結(jié)晶的成功，學(xué)者們又提出了1個新的電壓門控機制模型，即KvAP模型。該模型認為S3-S4形成1個槳狀物，游離于孔道區(qū)域之外，靜息狀態(tài)時，平行于膜的內(nèi)表面，除極化時，通過杠桿式外移轉(zhuǎn)為跨膜片段［2］。兩大機制模型分歧的焦點在于電壓感受器S4的結(jié)構(gòu)特點，如S4在膜中所處的位置，S4與其他跨膜片段的空間位置關(guān)系等。膜拓撲結(jié)構(gòu)分析是研究膜蛋白的各個跨膜片段在蛋白合成的同時如何整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并最終形成什么樣的跨膜結(jié)構(gòu)。糖基化反應(yīng)常被用來分析膜蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)［3］，而糖基化反應(yīng)是否有效進行取決于其糖基化受體位點是否符合12-14規(guī)則［4］，此規(guī)則已被用來分析膜蛋白跨膜區(qū)的邊界［5］。本研究采用膜拓撲結(jié)構(gòu)分析和糖基化掃描方法分析了Kv家族中具有代表性的Shaker通道的電壓感受器S3-S4的膜拓撲結(jié)構(gòu)，旨在推斷其在膜中所處的位置，為分析電壓門控機制提供了結(jié)構(gòu)上的信息。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

采用2步PCR方法，去除Shaker通道的N端，以增加該蛋白的體外合成效率，同時通過點變異的方式去除Shaker通道位于S1-S2連接中的2個內(nèi)源性糖基化受體位點N259和N263，然后把來自于人帶3蛋白中含有1個糖基化受體位點的G-loop插入到S3-S4連接中，以分析S3-S4的膜拓撲結(jié)構(gòu)，最后把編碼ShakerS1-S4（K198-F401）區(qū)域的DNA融合到攜帶有PL報告基因的pCITE-2a載體（No－vagen，Madison，WI）中（圖1A）。

1.2 無細胞系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯及轉(zhuǎn)運實驗

將所有質(zhì)粒通過ScaI酶切線性化，在標(biāo)準(zhǔn)條件下利用T7 RNA多聚酶進行體外轉(zhuǎn)錄，37℃，1 h。把獲得的mRNA在含有或不含有狗胰腺粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡（rough microsome，RM）的兔網(wǎng)織紅細胞抽出液系統(tǒng)中進行體外蛋白合成和轉(zhuǎn)運，30℃，1 h。采用蛋白激酶K對在含有RM條件下合成的蛋白產(chǎn)物進一步進行蛋白水解實驗，用［35S］蛋氨酸標(biāo)記蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白產(chǎn)物，最后進行同位素自顯影。

1.3 糖基化掃描方法

在已獲得有效糖基化的ShakerS1-S4構(gòu)建體基礎(chǔ)上，把NSS受體位點分別引進到S3-S4連接的不同位置（圖2A），然后根據(jù)糖基化的有無及其程度和12-14規(guī)則來推測可能的S3、S4跨膜末端。糖基化效率由糖基化的蛋白帶的強度除以糖基化蛋白帶與未被糖基化的蛋白帶強度之和計算獲得。有效的糖基化效率定義為至少應(yīng)該達到最大糖基化效率的一半，突然的糖基化效率下降可視為該糖基化位點超出所謂的12-14距離。

2 結(jié)果

2.1 Shaker中S1-S4的膜拓撲結(jié)構(gòu)分析

在未添加RM的條件下，ShakerS1-S4-PL經(jīng)體外合成后，出現(xiàn)1條分子量約為50 kDa的蛋白帶，這是未被糖基化的蛋白帶（圖1B）。在RM存在的條件下，出現(xiàn)1條明顯的糖基化蛋白帶，分子量比未被糖基化的蛋白帶多出約3 kDa。在RM存在條件下獲得的蛋白經(jīng)過蛋白激酶K處理后，所有蛋白帶消失。提示Shaker的S3-S4能被有效地轉(zhuǎn)移整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，S3是以Ncyt/Cexo的方向，S4是以Ncyt/Cexo的方向插入到膜上的（圖1C）。

2.2 Shaker中S3、S4片斷末端氨基酸殘基分析

圖2B為糖基化掃描的SDS-PAGE結(jié)果，其糖基化效率見圖3A。NSS位點在G20的構(gòu)建體是基礎(chǔ)質(zhì)粒（同圖1），其糖基化效率（36.0%±1.8%）與圖1相似，為有效糖基化。第1個被糖基化的受體位點位于殘基342，其糖基化效率為28.0%±2%；最后1個被糖基化的受體位點位于殘基345，其糖基化效率為18.0%±0.8%，說明這2個受體位點恰好位于能與寡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性位點結(jié)合的最短距離。雖然最后幾個糖基化位點的效率偏低，但均能達到最大效率的50%，G38位點除外。根據(jù)12-14規(guī)則，可推測出Shaker中S3-S4跨膜片段的末端氨基酸位置（圖3C）。Shaker通道中，S3的C端位于T329，S4的N端位于L358。

2.3 Shaker中S3、S4片段膜中位置分析

SOSUI疏水性分析發(fā)現(xiàn)S3的N端起始于V311，C 端終止于 T329；S4的 N 端起始于 L358，C端終止于R377，見圖3B。其S3的C端殘基和S4的N端殘基與圖3C推測出的數(shù)據(jù)一致，由此推論Shaker的S3與S4均為跨膜片段。

3 討論

目前，常利用無細胞系統(tǒng)進行膜蛋白的體外轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)運實驗，然后根據(jù)合成的蛋白肽鏈?zhǔn)欠癜l(fā)生糖基化反應(yīng)，以及是否被蛋白水解酶降解等特點，分析膜蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)［3］。蛋白肽鏈的糖基化反應(yīng)通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)進行，在寡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，1個糖基化受體位點（Nsn-X-Ser/Thr，其中X為任何一種氨基酸）接受1個高甘露糖基寡聚糖，其分子量會增加2.5 kDa。圖1B中，在RM存在的條件下，糖基化蛋白帶的出現(xiàn)說明S3-S4連接位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細胞外），所以其人工導(dǎo)入的G-loop上的糖基化受體位點才能被糖基化。糖基化效率為（37.0±2.0）%，說明該位點被有效地糖基化。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蛋白肽鏈除了可發(fā)生糖基化反應(yīng)外，因受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的保護，不會被蛋白水解酶降解。圖1B中，在RM存在下獲得的蛋白肽鏈經(jīng)過蛋白激酶K處理后，所有蛋白帶消失，說明S1-S4蛋白肽鏈C端（含報告蛋白PL）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔外（細胞內(nèi)），因而被蛋白激酶K消化降解。由這些結(jié)果推斷出S3是以Ncyt/Cexo的方向，S4是以Ncyt/Cexo的方向整合到膜上的。

膜蛋白的糖基化反應(yīng)是否有效進行取決于膜蛋白的糖基化受體位點能否與膜上寡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性位點結(jié)合，而該活性位點距內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有一定的距離。1993年Nilsson等［4］利用大腸桿菌前導(dǎo)肽酶提出了12-14規(guī)則，認為糖基化受體位點的N端距內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面至少有12個殘基的距離，C端至少有14個殘基的距離，才能被有效糖基化［4］。

本研究通過糖基化掃描的方法，根據(jù)12-14規(guī)則，推測出ShakerS3-S4片段的細胞外末端氨基酸殘基，并由此推測出其在膜中可能的位置。因為膜蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)翻譯轉(zhuǎn)運的同時進行折疊，形成蛋白的3級結(jié)構(gòu)，因而其膜整合的一些結(jié)構(gòu)信息可能代表著膜蛋白的最終結(jié)構(gòu)信息。目前，對于Kv通道電壓門控機制的研究主要集中在電生理和X-ray結(jié)晶方面［6，7］，本研究試圖從膜拓撲結(jié)構(gòu)分析的角度對其進行評價。我們的糖基化掃描結(jié)果認為Shaker的S3、S4為跨膜片斷，與傳統(tǒng)的Shaker電壓門控機制模型一致，為電壓門控機制的研究提供了線索。

［1］Heginbotham L，Lu Z，Abramson T，et al.Mutations in the K+channel signature sequence［J］.Biophys J，1994，66（4）：1061-1067.

［2］Ahern CA，Horn R.Stirring up controversy with a voltage sensor paddle［J］.Trends Neurosci，2004，27（6）：303-307.

［3］Zhang L，Sato Y，Hessa T，et al.Contribution of hydrophobic and electrostatic interactions to the membrane integration of the Shaker K+channel voltage sensor domain ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（20）：8263-8268.

［4］Nilsson IM，von Heijne G.Determination of the distance between the oligosaccharyltransferase active site and the endoplasmic reticulum membrane［J］.J Biol Chem，1993，268（8）：5798-5801.

［5］Popov M，Tam LY，Li J，et al.Mapping the ends of transmembrane segments in a polytopic membrane protein.Scanning N-glycosylation mutagenesis of extracytosolic loops in the anion exchanger，band3［J］.J Biol Chem，1997，272（29）：18325-18332.

［6］Koag MC，Papazian DM.Voltage-dependent conformational changes of KVAP S4 segment in bacterial membrane environment［J］.Channels（Austin），20093（5）：356-365.

［7］Schow EV，F(xiàn)reites JA，Gogna K，et al.Down-state model of the voltage-sensingdomainofapotassiumchannel［J］.BiophysJ，2010，98（12）：2857-2866.