劉虹，韓芳，石玉秀

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指突發(fā)的巨大災(zāi)難（戰(zhàn)爭(zhēng)、地震等）或嚴(yán)重威脅的生活事件導(dǎo)致長(zhǎng)期持續(xù)存在的精神障礙［1］。臨床表現(xiàn)為記憶異常、焦慮、恐懼增強(qiáng)等精神癥狀［2，3］。海馬是邊緣系統(tǒng)中學(xué)習(xí)、記憶的重要部位［4］，還是應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞。我們前期的研究證實(shí)PTSD時(shí)杏仁核神經(jīng)元鈣超載［5］。海馬與杏仁核都屬于邊緣系統(tǒng)，而且相互聯(lián)系、相互影響。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究PTSD時(shí)海馬神經(jīng)元Ca2+濃度的變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場(chǎng)所，對(duì)應(yīng)激極為敏感。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊的伴侶蛋白。檢測(cè)分子伴侶CRT在PTSD大鼠海馬神經(jīng)元的表達(dá)變化，探討CRT對(duì)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+信號(hào)的調(diào)節(jié)，為研究PTSD海馬記憶異常的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。本研究采用國(guó)際公認(rèn)的單一延長(zhǎng)應(yīng)激（single-prolonged stress，SPS）方法制備PTSD動(dòng)物模型，用免疫組織化學(xué)、免疫印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元分子伴侶CRT在PTSD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表達(dá)變化，用熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化，為揭示PTSD所致的記憶異常的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠（購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量150～180 g，12 h光亮/黑暗條件、溫度22～25℃，常規(guī)喂養(yǎng)，自由攝食飲水。隨機(jī)分為SPS1 d、4 d、7 d組及正常對(duì)照組，每組5只。

1.2 SPS模型的建立

采用國(guó)際公認(rèn)PTSD動(dòng)物模型制備方法［6］——SPS。SPS具體步驟：大鼠禁錮2 h后，強(qiáng)迫游泳20 min（水深 40 cm，水溫25℃），休息15 min后，乙醚麻醉至意識(shí)喪失。麻醉后將大鼠置于通風(fēng)處至自然蘇醒，無(wú)干擾喂養(yǎng)，常規(guī)飲食直至取材。

1.3 光鏡標(biāo)本制備

大鼠經(jīng)0.4%戊巴比妥麻醉后，4%多聚甲醛心臟灌流，取材，續(xù)固定3 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm。

1.4 CRT的免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復(fù)，采用SABC法，各步驟間均用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。主要步驟：（1）0.3%TritonX-100室溫10 min；（2）3%H2O2室溫孵育10 min；（3）5%BSA 室溫20 min；（4）一抗 4 ℃過(guò)夜，兔多克隆抗體 CRT（英國(guó)Abcam 公司，1∶500）；（5）二抗及 SABC（SABC 試劑盒，武漢博士德公司）均37℃孵育20 min；（6）DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗數(shù)分鐘，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。免疫反應(yīng)對(duì)照組用0.01 mol/L PBS代替一抗，其他步驟同上。光學(xué)顯微鏡（80i，日本Nikon公司）下觀察，攝片。

1.5 CRT的免疫印跡法檢測(cè)

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，加入裂解液，提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法定量后，SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，封閉，一抗兔多克隆抗體CRT（英國(guó)Abcam公司，1∶1000）和小鼠單克隆抗體GAPDH（北京中杉金橋，1∶1000）4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（北京中杉金橋，1∶2000）室溫孵育1 h，ECL顯色。利用天能GIS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH的平均吸光度的比值表示相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

1.6 CRT的RT-PCR檢測(cè)

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，利用Trizol試劑提取總RNA。分光光度計(jì)定量后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，CRT的引物序列：上游5′-CAAGGATATCC GGTGTAAGGA-3′，下 游5′-CATAGATATTCGCAT CGGGG-3′；β-actin 的引物序列：上游5′-GTCACCCA CACTGTGCCCATC-3′，下游5′-ACAGAGTACTTGCG CTCAGGAG-3′。CRTPCR 擴(kuò)增條件：94 ℃5 min，94℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min；β-actinPCR 擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，58℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃8 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用天能GIS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照并進(jìn)行積分光密度分析，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

1.7 海馬細(xì)胞游離Ca2+濃度測(cè)定

大鼠處死后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，制備1×l06～1×107/mL的細(xì)胞懸液，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢查細(xì)胞成活率達(dá)95%以上后，加入2.5 μL預(yù)冷的Fura-2/AM（美國(guó)Sigma公司）37℃水浴箱避光孵育40 min；熒光分光光度計(jì)（F-4500，日本 HITACHI公司）檢測(cè)，發(fā)射波長(zhǎng)為500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm和380 nm。測(cè)定時(shí)依次記錄靜息、加入10%TritonX-100和0.3%EDTA后340 nm與380 nm的熒光比值，利用公式計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量（nmol/L）=Kd（R-Rmin）F0/（Rmax-R）Fs。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元CRT的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

CRT陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞質(zhì)。正常對(duì)照組（圖1A）大鼠海馬陽(yáng)性細(xì)胞少。SPS1d組CRT的表達(dá)增多（圖1B），SPS 7 d組表達(dá)最多（圖1C）。

2.2 海馬CRT的免疫印跡結(jié)果

CRT和GAPDH的分子量分別為64和36 kDa，條帶清晰（圖2A）。以GAPDH的吸光度值作為內(nèi)參照，對(duì)各組條帶的吸光度值進(jìn)行校正和半定量分析。SPS1d、4 d、7 d組與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2B），SPS 7 d 組海馬 CRT的表達(dá)最多。

2.3 海馬CRT的RT-PCR結(jié)果

PCR結(jié)果（圖3A）顯示，正常對(duì)照組大鼠海馬中CRTmRNA 均有一定的表達(dá)，SPS1d、4 d、7 d 組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05，圖3B），SPS 7 d組海馬CRT的表達(dá)最多。

2.4 海馬細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+檢測(cè)

SPS1d、4 d、7 d組和正常對(duì)照組海馬細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度分別為（390.335±9.917）、（360.138±9.411）、（336.304±7.413）和（301.534±5.725）nmol/L。SPS1d組大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增至頂峰，之后逐漸下降。

3 討論

PTSD是指由于災(zāi)害、戰(zhàn)爭(zhēng)、交通意外等異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致出現(xiàn)長(zhǎng)期持續(xù)性精神障礙，其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征，并伴有情緒的易激惹和回避行為。簡(jiǎn)而言之，PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)［15，16］。海馬是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的重要腦區(qū)，是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)并受應(yīng)激影響的敏感區(qū)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后正確折疊的場(chǎng)所，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)及儲(chǔ)存Ca2+的場(chǎng)所。CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合蛋白，具有特殊的功能結(jié)構(gòu)域［7，8］，由高度保守的N區(qū)、富含脯氨酸的P區(qū)和酸性的C區(qū)構(gòu)成。其中C區(qū)具有高容量的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，有很強(qiáng)的與Ca2+結(jié)合的能力，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的存儲(chǔ)，調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+平衡，從而在機(jī)體鈣平衡中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明PTSD海馬神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度增高，為減輕胞質(zhì) Ca2+超載［9］，CRT 表達(dá)上調(diào)。另外CRT作為分子伴侶參與處理未折疊蛋白反應(yīng)［10］，減輕錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的聚積。CRT的C末端存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL，確保滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行正確折疊，并轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體［11，12］。Molinari等［13］證實(shí)，CRT缺陷的細(xì)胞系其蛋白質(zhì)折疊正確性大大降低。PTSD導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，激活未折疊蛋白反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRT表達(dá)上調(diào)，協(xié)助處理未折疊蛋白反應(yīng)。過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)功能受損，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)路徑細(xì)胞凋亡［17］。另外 Okunaga等［14］的研究表明CRT過(guò)表達(dá)改變Ca2+穩(wěn)態(tài)上調(diào)PP2A表達(dá)，抑制Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)分化依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。本研究揭示了分子伴侶CRT在PTSD大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用。PTSD導(dǎo)致海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣超載、CRT表達(dá)上調(diào)，引發(fā)細(xì)胞凋亡，也為解釋PTSD學(xué)習(xí)和記憶功能異常的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

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