王 慧，王 旭，唐卉凌，白麗敏

(1.貴州省貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部，貴陽 550002;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100029)

睡眠占據(jù)人類生命1/3左右的時(shí)間，睡眠障礙常導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動與內(nèi)臟功能活動紊亂，嚴(yán)重影響人類的健康和工作能力。腦內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)已經(jīng)被證明與睡眠和覺醒具有密切關(guān)系。臨床研究已證實(shí)，針刺對睡眠障礙具有良好的治療作用［1-2］，但針刺如何影響活體中樞單胺類遞質(zhì)活動變化目前尚未明確，故我們采用微透析法研究針刺“神門”穴及“命門”穴后中縫背核單胺類神經(jīng)遞質(zhì)活動變化，比較針刺不同經(jīng)穴腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)含量變化的差異，為針刺治療失眠癥的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠21只，體重160g±20g，由北京維通利華動物有限公司提供(動物許可證號SCXK(京)2006-0009)。

1.1.2 儀器和設(shè)備 腦立體定位儀(Small Animal Stereotaxic Frame，美國 ASI INSTRUMENTS);色譜儀(1100LC型，美國 Agilent);色譜泵(G1311A型，美國 Agilent);自動進(jìn)樣器(G1313A型，美國 Agilent);色 譜 柱:HPLC ColumnC18(2.1mm ×100mm，3μm，德國 SYKAM);電化學(xué)檢測器(DECADEⅡSDC型，荷蘭 ANTEC)，鉑金電極，動物微透析系統(tǒng)(美國BAS);微透析管(Microdialysis Probe，瑞典 CMA)，微透析灌注泵(Baby Bee，美國BAS)，冷卻微量收集器(Honey Comb，美國 BAS)。針具:0.40mm×25mm環(huán)球牌無菌針灸針。

1.1.3 藥品與試劑 5-HT、NE、DA和Homovanillic acid(HVA)標(biāo)準(zhǔn)品購自 Sigma公司。色譜級甲醇(Fisher)、磷酸二氫鈉、辛烷磺酸鈉、乙二胺四乙酸、氯化鉀均為分析純(Alfa Aesar)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及針刺方法 雄性SD大鼠21只隨機(jī)分為空白對照組、針刺“神門”組和針刺“命門”組，每組7只。根據(jù)郭義主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［3］，并以比較解剖和骨度分寸法取穴，用0.35×25mm規(guī)格毫針，手針刺激“神門”穴位，直刺約1mm;“命門”穴位，直刺約5mm～6mm;持續(xù)20min。

1.2.2 微透析管的埋置和微透析液的收集動物用20%氨基甲酸乙酯(1g/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于立體定位儀上。用顱骨鉆鉆開一直徑為2mm的顱窗，仔細(xì)挑破硬腦膜，按照Paxinos和watson大鼠腦立體定位圖譜將微透析管插入DRN(AP: －7.3mm，L/R 0.0 mm、H:6.4mm)。微透析管膜長3mm，外徑為0.5mm。用Ringer氏液以2μl/min的速度灌流，每 20 min收集一管透析液(40μl)。微透析管置入60min后正式收集微透析液，以取得穩(wěn)定的基礎(chǔ)值。針刺前40min收集2次作為對照，然后收集針刺結(jié)束后 20、40、60、80、100、120min，共2h各時(shí)相點(diǎn)的透析液，用于測定5-HT、NE、DA和HVA的含量。樣本收集器的溫度設(shè)定為4℃。收集完畢后的微透析液樣品置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定 利用Agilent 1100LC型高效液相色譜儀系統(tǒng)測定透析液中5-HT、NE、DA和 HVA。流動相:磷酸二氫鈉:100mM，辛烷磺酸鈉:0.74mM，乙二胺四乙酸:0.027mM，氯化鉀:8mM，甲醇 10%，流速0.2ml/min。

1.2.4 探針回收率的測定 將探針置入0.34ng/μl的混合對照品液中，以與腦內(nèi)微透析相同的灌流液、流速和間隔時(shí)間收集體外透析液，并按前述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算各物質(zhì)的相對回收率分別為5-HT:11.99%、NE:13.06%、HVA:13.19%、DA:14.23%。

1.2.5 組織學(xué)鑒定 大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用外徑為0.3mm的單級不銹鋼電極插入引導(dǎo)管通以3 mA陽極直流電10s電損毀中縫背核，取腦置于4%多聚甲醛溶液，2d后做腦組織切片，觀察引導(dǎo)管軌跡頂部是否位于DRN，僅對定位準(zhǔn)確的大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 針刺“神門”和“命門”穴對中縫背核5-HT含量的影響

表1顯示，針刺“神門”穴和“命門”穴后 20 min，中縫背核5-HT含量明顯下降，與對照組相比，針刺后各時(shí)相點(diǎn)之間5-HT含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與針刺前的基礎(chǔ)水平相比，針刺“神門”穴和“命門”穴后20min 5-HT水平顯著下降(P＜0.01)，在其后的2h維持在低水平，針刺“神門”穴與“命門”穴所引起的中縫背核5-HT含量變化之間并無顯著性差異，提示針刺“神門”穴和“命門”穴能降低中縫背核5-HT含量，且持續(xù)時(shí)間長于2h。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核5-HT含量變化比較(pg/μl，±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核5-HT含量變化比較(pg/μl，±s)

注:與對照組同一時(shí)間點(diǎn)比較:＊＊＊P＜0.001;與本組刺激前比較:△△P＜0.01

組 別 例數(shù) 針刺前 針刺后20min 針刺后40min 針刺后60min 針刺后80min 針刺后100min 針刺后120min對 照 組 6 1.2±0.60 0.87±0.33 0.76±0.31 0.80±0.37 0.81±0.39 0.81±0.33 0.79±0.32針刺神門組 6 1.0 ±0.50 0.05 ±0.04＊＊＊△△ 0.03 ±0.02＊＊＊△△ 0.04 ±0.02＊＊＊△△ 0.05 ±0.05＊＊＊△△ 0.06 ±0.04＊＊＊△△ 0.05 ±0.05＊＊＊△△針刺命門組 6 0.9 ±0.41 0.06 ±0.02＊＊＊△△ 0.06 ±0.02＊＊＊△△ 0.05 ±0.03＊＊＊△△ 0.03 ±0.02＊＊＊△△ 0.04 ±0.02＊＊＊△△ 0.04 ±0.01＊＊＊△△

2.2 針刺“神門”和“命門”穴對中縫背核 NE含量的影響

表2顯示，針刺“神門”穴后 20min，中縫背核NE含量明顯下降，與對照組相比，針刺后20、40、60、80、100min各時(shí)相點(diǎn)之間NE含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但針刺“神門”120min時(shí)相點(diǎn)NE含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。針刺“命門”穴后20min，中縫背核NE含量明顯下降，與對照組相比，針刺后各時(shí)相點(diǎn)之間NE含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與針刺前的基礎(chǔ)水平相比，針刺“神門”穴和“命門”穴后20minNE水平顯著下降(P＜0.01)，在其后的2h維持在低水平。針刺“神門”穴與“命門”穴所引起的中縫背核 NE含量變化之間在針刺40min時(shí)相點(diǎn)處(針刺神門穴后NE含量較低)具有顯著性差異(P＜0.05)，其余各時(shí)相點(diǎn)無顯著性差異。提示針刺“神門”穴和“命門”穴能降低中縫背核 NE含量，針刺“神門”穴降低NE含量的作用在針刺1h內(nèi)可能強(qiáng)于“命門”穴，但持續(xù)的時(shí)間較“命門”穴短。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核NE含量變化比較(pg/μl，±s)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核NE含量變化比較(pg/μl，±s)

注:與對照組同一時(shí)間點(diǎn)比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001; 與本組刺激前比較:△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

組 別 例數(shù) 針刺前 針刺后20min 針刺后40min 針刺后60min 針刺后80min 針刺后100min 針刺后120min對 照 組 6 0.55±0.07 0.57±0.12 0.58±0.11 0.59±0.08 0.64±0.04 0.54±0.11 0.54±0.13針刺神門組 7 0.53 ±0.03 0.32 ±0.09＊＊＊△△ 0.24 ±0.04＊＊＊△△△ 0.25 ±0.07＊＊＊△△△ 0.29 ±0.05＊＊＊△△△ 0.39 ±0.07＊＊△△ 0.47 ±0.06△針刺命門組 7 0.56±0.04 0.34±0.16＊＊△△ 0.36±0.11＊＊△△ 0.31±0.11＊＊＊△△△ 0.33±0.07＊＊＊△△△ 0.36±0.13＊△△ 0.40±0.14＊△

2.3 針刺“神門”和“命門”穴對中縫背核HVA含量的影響

表3顯示，本研究在中縫背核未檢測出DA，但我們檢測到DA的代謝產(chǎn)物 HVA。針刺“神門”穴和“命門”穴后20min，中縫背核 HVA含量明顯下降，與對照組相比，針刺后各時(shí)相點(diǎn)之間含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與針刺前的基礎(chǔ)水平相比，針刺“神門”穴和“命門”穴后20min HVA水平顯著下降(P＜0.01)，在其后的2h維持在低水平，針刺“神門”穴與“命門”穴所引起的中縫背核HVA含量變化之間并無顯著性差異，提示針刺“神門”穴和“命門”穴能降低中縫背核HVA含量，且持續(xù)時(shí)間長于2h。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核HVA含量變化比較(pg/μl，±s)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)中縫背核HVA含量變化比較(pg/μl，±s)

注:與對照組同一時(shí)間點(diǎn)比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001; 與本組刺激前比較:△△P ＜0.01

組 別 例數(shù) 針刺前40min 針刺后20min 針刺后40min 針刺后60min 針刺后80min 針刺后100min 針刺后120min對 照 組 6 18.95±4.11 17.97±4.01 17.31±3.20 17.64±4.24 17.13±3.95 18.86±4.13 18.09±4.54針刺神門組 7 18.64 ±2.50 12.63 ±2.10＊＊△△ 11.44 ±3.51＊＊△△ 11.09 ±2.56＊＊△△ 10.44 ±2.20＊＊△△ 10.45 ±3.23＊＊＊△△ 9.96 ±2.38＊＊＊△△針刺命門組 7 18.65±4.47 13.30±2.43＊△△ 12.90±2.28＊＊△△ 10.64±2.61＊＊△△ 10.06±2.10＊＊＊△△ 10.48±1.29＊＊＊△△ 9.97±3.01＊＊△△

3 討論

睡眠障礙嚴(yán)重影響人類的身心健康［4］。大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，針刺治療睡眠障礙類疾病具有較好的療效，但是其作用機(jī)制目前尚未明確。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在睡眠與覺醒的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。以往的研究通常采用分析腦勻漿或腦脊液中生化物質(zhì)的含量來進(jìn)行，這些方法不能直接反映活體細(xì)胞外液中生化物質(zhì)的動態(tài)變化，從而限制了對腦細(xì)胞直接生存的微環(huán)境的研究。微透析技術(shù)能在腦組織損傷極小的情況下，準(zhǔn)確地監(jiān)測生理及病理狀態(tài)下細(xì)胞外液中化學(xué)物質(zhì)濃度的動態(tài)改變［5］，故本研究運(yùn)用微透析法連續(xù)2h觀察了針刺大鼠“神門”穴及“命門”穴后中縫背核單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化。研究結(jié)果顯示，針刺“神門”及“命門”穴可明顯降低大鼠中縫背核細(xì)胞外液中5-HT、NE和HVA含量。

5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在睡眠調(diào)節(jié)中起到重要作用。實(shí)驗(yàn)證明，在覺醒時(shí)5-HT神經(jīng)元的興奮性最高，進(jìn)入非快速眼動睡眠期(NREM)后其興奮性下降，在快速眼動睡眠期(REM)其興奮性最低［6］。DRN是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富含5-HT能神經(jīng)元的一個(gè)重要核團(tuán)，其纖維投射到丘腦、下丘腦、海馬、基底神經(jīng)節(jié)和大腦皮層，DRN的神經(jīng)元投射到上位中樞主要形成慢波睡眠(SWS)和觸發(fā)快波睡眠(FWS)［4］。目前已經(jīng)明確中腦藍(lán)斑核(LC)的去甲腎上腺素能神經(jīng)元的纖維投射到DRN，從而影響5-HT神經(jīng)元的活動［7-8］。LC是腦內(nèi)最重要的 NE能神經(jīng)中樞，一般來說，LC的神經(jīng)元放電活動在SWS時(shí)減少，在REM時(shí)放電停止。REM睡眠被剝奪時(shí)，LC放電活動仍然持續(xù);α1受體激動劑可減少大鼠REM睡眠，LC局部注射α2受體激動劑能非常顯著地減少REM睡眠，說明LC的NE能神經(jīng)元與REM的產(chǎn)生密切相關(guān)［9］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，去甲腎上腺素能傳入纖維通過α1受體從而激活DRN的5-HT能神經(jīng)元放電活動［10］，α2受體被激活則減少 DRN5-HT的合成［11］。我們以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針刺能降低 LC神經(jīng)元的放電活動［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺能降低DRN內(nèi)5-HT和NE的含量，提示針刺可能通過改變LC神經(jīng)元的活動，從而影響DRN內(nèi)NE神經(jīng)遞質(zhì)，進(jìn)而改變DRN內(nèi)5-HT的含量，影響到其投射區(qū)皮層的活動。

目前已明確，黑質(zhì)的DA遞質(zhì)系統(tǒng)在維持行為覺醒機(jī)制中的重要作用［7］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 DA神經(jīng)元主要集中在黑質(zhì)致密區(qū)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)，其末梢分別投射到紋狀體、邊緣系統(tǒng)和大腦皮層，許多精神運(yùn)動興奮劑引起的覺醒效應(yīng)主要是通過多巴胺及其受體而發(fā)揮作用。本次實(shí)驗(yàn)中我們在中縫背核未能檢出DA，可能是活體對該神經(jīng)遞質(zhì)的滅活與再攝取使其在DRN含量過低，由于DA可在單胺氧化酶的作用下最終轉(zhuǎn)化為高香草酸(HVA)，本實(shí)驗(yàn)在DRN檢出了DA的代謝產(chǎn)物HVA，且針刺后該物質(zhì)含量顯著下降，說明中縫背核神經(jīng)元的活動與DA也有一定關(guān)系。但由于遞質(zhì)作用的復(fù)雜性，DA與5-HT能神經(jīng)元之間如何相互協(xié)同，還有待于我們進(jìn)一步了解。

中醫(yī)理論稱失眠癥為不寐，其病因病機(jī)乃各種原因?qū)е碌年庩柺д{(diào)，治療的關(guān)鍵在于調(diào)節(jié)陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)，恢復(fù)正常功能。神門具有寧心安神、通經(jīng)活絡(luò)的作用，是臨床常用的治療失眠癥的穴位。命門穴屬督脈，督脈因其“總督諸陽”，具有整體調(diào)整作用而多被使用。本研究結(jié)果提示，針刺神門和命門穴能通過改變中腦中縫背核神經(jīng)遞質(zhì)含量，從而起到調(diào)節(jié)睡眠的作用，針刺神門和命門穴引起的單胺類遞質(zhì)含量變化差異不大。該結(jié)果為針刺治療睡眠障礙類疾病提供了科學(xué)的依據(jù)。

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