張云莎，馬東明，盧 斌，馬軼文，姜希娟

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，天津 300193；3.天津市塘沽區(qū)婦幼保健院，天津 300451）

近年來，銀杏葉有效單體被廣泛用于防治阿爾茨海默?。ˋD），取得了較好的療效，但其作用機(jī)制尚未完全闡明?；谀X膽固醇代謝紊亂在AD發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，或可假定銀杏葉有效單體銀杏內(nèi)酯A、B能通過調(diào)節(jié)腦膽固醇代謝起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

前期工作中，筆者建立體外血腦屏障（BBB）環(huán)境下PC12細(xì)胞的高膽固醇損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇環(huán)境下，PC12細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量增加，而銀杏內(nèi)酯A（GKA）和銀杏內(nèi)酯B（GKB）可以有效降低上述模型的細(xì)胞總膽固醇含量，其中以30 μmol/L GKA和25 μmol/L的GKB效果最佳[1]?；诖私Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來探討GKA及GKB對PC12細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝關(guān)鍵酶的影響，闡釋GKA、GKB防治AD的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 PC12細(xì)胞株（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤），購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

1.2 藥品及試劑 DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），馬血清（Gibco），多聚－L－賴氨酸（Sigma），可溶性膽固醇（Sigma Cat NO.P6282），辛伐他?。⊿igma），銀杏內(nèi)酯 A（Ginkgolide A，NO.110862）和銀杏內(nèi)酯 B（Ginkgolide B，NO.110863）標(biāo)準(zhǔn)品購自寶雞貝斯特植物原料有限公司，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）二步法試劑盒（ABI），TRIZOL Reagent（Invitrogen），Tris、DEPC（Sigma）。其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（SANYO），超凈化工作臺（日立），IX－70型倒置顯微鏡（Olympus），Universal 16R低溫高速離心機(jī)（Beckman）；ABIPrism7000PCR儀（ABI）。

1.4 體外血腦屏障環(huán)境下PC12細(xì)胞膽固醇損傷模型建立 參照文獻(xiàn)[2]利用Transwell裝置培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，建立BBB體外模型。將BBB置于培養(yǎng)有PC12細(xì)胞的6孔板內(nèi)，然后在Transwell內(nèi)皮細(xì)胞側(cè)加入含40 μmol/L終濃度可溶性膽固醇的培養(yǎng)基繼續(xù)作用24 h，作為高膽固醇損傷模型[3]。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 對照組（C），普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組（M），40 μmol/L 膽固醇處理 24 h,更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h；GKA組，40 μmol/L膽固醇處理24 h,更換含30 μmol/L GKA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h；GKB組，40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換含25 μmol/L GKB的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

1.6 RT-PCR測定膽固醇代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總核糖核酸（RNA）。依試劑盒說明書，采用TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒和oligod（T）16 引物將總 RNA（0.2μg）反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）（10 μL體系）。0.5 μL的cDNA產(chǎn)物用作定量PCR擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用SYBR Green PCR Master Mix reagent kits試劑盒和特異性引物（見表1）。數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT相對定量法分析。

表1 引物種類及引物序列Tab.1 Primer type and primer sequences

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件分析，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較時若方差齊則選用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊則選用Tam hane’s T2法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

高膽固醇環(huán)境下，調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇攝入的關(guān)鍵物質(zhì)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（LRP-1）表達(dá)降低（P＜0.01）；細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化關(guān)鍵酶乙酰膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（ACAT）及膽固醇流出關(guān)鍵通道蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子 A1（ABCA1）表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；膽固醇羥化酶24S-羥化酶（CYP46）的表達(dá)無變化。藥物干預(yù)后，上調(diào)了LRP-1的表達(dá)（P＜0.05），但對其他酶的表達(dá)無明顯影響。見表2。

3 討論

近年來的研究表明，外周高膽固醇血癥可以影響B(tài)BB的通透性引起腦膽固醇水平升高，而且膽固醇代謝通路中的關(guān)鍵物質(zhì)可以直接參與到AD的發(fā)生發(fā)展過程中。

腦內(nèi)膽固醇主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成，由載脂蛋白E經(jīng)LRP轉(zhuǎn)運(yùn)給神經(jīng)元。一部分游離膽固醇被神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的ACAT酯化，ACAT是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝和分布的關(guān)鍵成分。另外一部分膽固醇經(jīng)膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白（CERP）排出細(xì)胞外，構(gòu)成膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的第一步，其中ABCA1起主要作用；最后腦膽固醇在CYP46的作用下轉(zhuǎn)化為24S-羥膽固醇，后者能夠通過BBB，由低密度脂蛋白（LDL）轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝。

表2 高膽固醇環(huán)境下PC12細(xì)胞膽固醇代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)及GKA、GKB的影響（n=8）Tab.2 The effects of GKA and GKB on cholesterol metabolism key enzymes in PC12 cells exposed to high cholesterol（n=8）

β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是AD的主要病理學(xué)特征。正常腦組織內(nèi)Aβ的含量取決于合成與清除的速率。Aβ由淀粉樣前體蛋白（APP）加工合成，主要經(jīng)由腦內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的LRP介導(dǎo)，經(jīng)BBB流出到外周[4]。有研究發(fā)現(xiàn)腦組織中Aβ明顯沉積的AD患者，LRP水平下調(diào)；上調(diào)LRP的表達(dá)后，Aβ的沉積減少[5]。Aβ沉積導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失，因此，持續(xù)有效的清除Aβ是避免其在腦內(nèi)沉積的重要機(jī)制。靶向LRP的治療已成為防治AD的重要策略之一。

目前研究表明神經(jīng)元內(nèi)膽固醇的分布形式影響著Aβ的產(chǎn)生。ACAT在細(xì)胞內(nèi)膽固醇分布中起著關(guān)鍵作用，它可能通過調(diào)節(jié)膽固醇與膽固醇酯的動態(tài)平衡而影響Aβ的產(chǎn)生[6]。有研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量越高，Aβ的產(chǎn)生越多，反之亦然[7]。Hutter-Paier等[8]在APP轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中給予ACAT抑制劑后，發(fā)現(xiàn)小鼠腦中Aβ沉積減少；進(jìn)一步的研究表明ACAT可能通過影響APP裂解方式促進(jìn)Aβ合成，ACAT的活性輕度降低就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制Aβ生成作用[9]。

ABCA1是一種膜相關(guān)蛋白，主要是利用ATP將膽固醇從細(xì)胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移至外層，使其與載脂蛋白結(jié)合，從而介導(dǎo)膽固醇的外流。研究表明，ABCA1在載脂蛋白E結(jié)合膽固醇的過程中發(fā)揮重要作用。過表達(dá)ABCA1的小鼠，可增強(qiáng)脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Aβ的沉積[10]。而24S-羥膽固醇作為腦膽固醇代謝的最終產(chǎn)物，在腦脊液中的蓄積也發(fā)揮著神經(jīng)毒性作用，引起神經(jīng)退行性變[11]。24S-羥化酶的活性決定24S-羥膽固醇的濃度，近年來多項(xiàng)研究顯示[12-13]，CYP46基因的多態(tài)性與Aβ沉積密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇環(huán)境下，PC12細(xì)胞高表達(dá)了ACAT及ABCA1，低表達(dá)了LRP，提示外周高膽固醇血癥可能會影響腦內(nèi)膽固醇代謝相關(guān)酶的表達(dá)；給予藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，除LRP水平上調(diào)外，其余無明顯改變，提示GKA、GKB可能通過調(diào)控LRP的水平，促進(jìn)Aβ的清除，達(dá)到防治AD的作用。

[1]郭茂娟,范英昌,盧 斌,等.銀杏內(nèi)酯B對高膽固醇誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞膽固醇含量的影響[J].中國病理生理雜志，2012，28（1）：173－176.

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