尹新中，劉桂穎，朱振剛，狄冠麟，陳 磊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬?？滇t(yī)院，天津 300193）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預(yù)防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發(fā)展[1]。其患病人數(shù)多，病死率高[2]。

痰液是影響COPD病情和預(yù)后的危險因素，同時也是其病理產(chǎn)物，更是治療COPD的關(guān)鍵。本實驗通過清肺化痰膠囊對COPD大鼠氣道上皮細胞水通道蛋白-5（AQP-5）表達和肺組織勻漿中的中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）水平的影響進而探討中藥治療COPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar成年大鼠，鼠齡200 d，體質(zhì)量（200±20）g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 AQP-5免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、NE酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）A試劑盒（北京尚柏生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 大鼠實驗環(huán)境馴養(yǎng)1周后，36只大鼠按隨機數(shù)字表法分為6組（模型組、空白組、清肺化痰組、氨溴索組、痰熱清組、紅霉素組），每組6只。參照文獻宋一平[3]、李澤庚[4]的方法制備COPD大鼠模型：6個實驗的大鼠除空白組外均參照文獻進行造模，即第1天和第14天氣管內(nèi)注入脂多糖（LPS）200 μg/200 μL，第 2～13 天、第 15～28天在72 L密閉箱內(nèi)熏5%大前門牌香煙，0.5 h，每日上午。

1.2.2 藥物制備及給藥方法 實驗用藥由天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房統(tǒng)一購進。大鼠的用藥劑量按體表面積[5]比值進行換算，持續(xù)給藥14 d。模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃；空白組不給藥；清肺化痰組給予清肺化痰膠囊溶液灌胃，按劑量0.56 g/（kg·d）給藥（清肺化痰膠囊配制成0.14 g/mL混懸液）；氨溴索組給予鹽酸氨溴索注射液腹腔注射，2.7 mg/（kg·d）；痰熱清組給予痰熱清注射液腹腔注射，1.8 mL/（kg·d）；紅霉素組給予乳糖酸紅霉素腹腔注射，0.09 g/（kg·d）。

1.2.3 標本制備 實驗第29天將大鼠頸椎脫臼處死。自劍突下由皮膚至皮下向上剪開胸腔，迅速暴露肺部，取左肺上葉和主支氣管，生理鹽水漂洗干凈，吸水紙拭干，置于10%中性甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明標本，浸蠟，包埋，切片。0.2 g右肺中葉組織勻漿分別離心后留取上清液待檢測。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 AQP-5的檢測 參照陳國兵[6]、王可[7]、劉少濱[8]的方法，5 μm切片脫蠟至水,3%的過氧化氫（H2O2）滅活內(nèi)源性過氧化物酶5～10 min，熱修復(fù)抗原，10%正常血清封閉 20 min，一抗（1∶1600）為兔抗大鼠AQP-5多克隆抗體，4℃過夜，加生物素化山羊抗兔 IgG（二抗），37℃，20 min，滴加鏈霉素和素復(fù)合體（SABC），37℃，20 min，各步后均在磷酸鹽緩沖液（PBS）中漂洗數(shù)次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，電子顯微鏡觀察，照相。陰性對照組滴加PBS代替AQP-5一抗，處理同前。染色結(jié)果判定：肺組織出現(xiàn)明確的棕黃或棕褐色顆粒為陽性。每組于400倍高倍鏡下隨機選取30個視域，用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。以0.207 μm 象素點長，在 1.8256×104μm2測量窗下，測量棕黃色反應(yīng)物信號的總面積（一個視域中陽性信號的總面積）、面積百分比（總面積與參考面積之比，也稱面密度）、積分光密度（各個單獨探測象素密度分布的總和，反應(yīng)陽性信號的強度），分析各組大鼠肺細支氣管上皮對AQP-5表達的相對水平。

1.2.4.2 NE的檢測 按照中性粒細胞彈性蛋白酶ELISA說明書，測定肺組織勻漿上清的NE。操作步驟簡述如下：1）加樣。2）棄去液體，甩干，不用洗滌。3）溫育，棄液，甩干，洗板。4）加檢測溶液B工作液，溫育。5）棄液，甩干，洗板。6）加底物溶液，顯色。7）加終止液。8）用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行。實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理改變 光鏡下（×100、×400）觀察：模型組大鼠支氣管上皮變性、壞死，纖毛缺失；管壁增厚，部分區(qū)域黏膜層上皮細胞脫落、不完整。肺泡壁可見塌陷、肺泡腔擴大及大泡形成；間質(zhì)及大氣管黏膜下可見大量淋巴細胞、中性粒細胞及組織細胞浸潤，小動脈壁明顯增厚?？瞻捉M未見上述改變。其余各治療組大鼠肺組織病理改變均輕于模型組，鏡下可見支氣管上皮輕度變性、脫落，部分纖毛缺失；管壁輕度增厚。肺泡壁未見明顯塌陷，偶見肺泡腔輕度擴大，未見大泡形成；間質(zhì)可見少量淋巴細胞浸潤。小動脈壁輕度增厚。見圖1、圖2。

2.2 各組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5免疫組化染色結(jié)果肺細支氣管上皮細胞AQP-5蛋白面積百分比、積分光密度模型組明顯低于清肺化痰組、沐舒坦組、紅霉素組、痰熱清組和空白組（P＜0.05）；清肺化痰組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；清肺化痰組高于沐舒坦組、紅霉素組、痰熱清組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 6組大鼠肺組織HE染色（×100）Fig.1 Lung tissue HE staining of six groups（×100）

圖2 6組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5免疫組化染色(×400)Fig.2 The immunohistochemical staining of AQP-5 bronchial epithelial cells(×400)

表1 各組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5表達（±s）Tab.1 Expression of AQP-5 in the bronchiolar epithelial cells of lung in rat（±s）

表1 各組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5表達（±s）Tab.1 Expression of AQP-5 in the bronchiolar epithelial cells of lung in rat（±s）

組別 n模型組 6空白組 6清肺化痰組 6痰熱清組 6紅霉素組 6沐舒坦組 6面積百分比（%）積分光密度(IOD值)1.353±0.5060112.958±44.1786.480±3.0001063.440±553.9425.230±1.6960599.235±166.3783.835±2.1210375.775±200.2041.679±1.0050201.229±128.0672.574±1.0940233.918±97.064

2.3 肺組織勻漿的NE含量檢測結(jié)果模型組明顯高于清肺化痰組、沐舒坦組、紅霉素組、痰熱清組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而清肺化痰組與空白組、痰熱清組、紅霉素組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），清肺化痰膠囊組明顯低于沐舒坦組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿NE水平（±s）Tab.2 The quantity of NE in the lung homogenate（±s）mg/mL

表2 各組大鼠肺組織勻漿NE水平（±s）Tab.2 The quantity of NE in the lung homogenate（±s）mg/mL

組別 n NE水平模型組 61.672±0.273空白組 60.445±0.104清肺化痰組 60.605±0.110痰熱清組 60.482±0.134紅霉素組 60.720±0.204沐舒坦組 61.048±0.138

3 討論

清肺化痰膠囊是本院呼吸科的協(xié)定處方，臨床用于治療COPD急性期患者頗有成效[9-10]。其依據(jù)COPD急性期以標實為主，多見“痰、熱、瘀”，以清肺化痰，活血化瘀為主要治法而擬成。方中炙麻黃、生石膏一辛溫，一辛寒，一宣肺，一清肺，且能透邪于外，合用則相反之中寓相輔之意，宣肺平喘而不助熱，清解肺熱而不涼遏。杏仁降利肺氣而平喘咳，與麻黃相配則宣降相因，與石膏相伍則清肅協(xié)同。吳繼全[11]認為肺系病常影響腸胃功能，肺氣不降易致胃氣不降，而有脹滿、大便不暢等表現(xiàn)，常選具有肺胃同治藥物,如杏仁。黃芩、瓜蔞清肺化痰，半夏、厚樸降氣化痰止咳，桃仁祛瘀通絡(luò)平喘，炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥相伍，共奏清肺化痰、活血祛瘀之功效。

黏液的黏稠度由黏蛋白和水分的多少決定，AQP-5是一參與水分轉(zhuǎn)運的跨膜蛋白，其表達與功能異常將引起水鹽代謝失衡而影響氣道黏液的黏稠度[12]。AQP不僅與水轉(zhuǎn)運有關(guān)，還可能參與氣道黏液分泌調(diào)節(jié)以及氣道反應(yīng)性的調(diào)節(jié)，因而AQP可能與氣道阻塞性疾病如COPD、肺囊性纖維化、哮喘等有關(guān)[13]。從目前的研究來看，已發(fā)現(xiàn)10余種AQP，其中AQP-5決定著氣道表面液體層的含水量，進而影響氣道表面液體層的理化性質(zhì)，影響著黏液纖毛清除系統(tǒng)的功能，從而影響?zhàn)ひ悍置跔顟B(tài)，因此，與呼吸道黏液高分泌相關(guān)的水通道蛋白多選用AQP-5[14]。陳智鴻等通過實驗研究表明AQP-5基因缺失可能使小鼠氣道過敏原的應(yīng)激性提高，從而促進黏液高分泌[15]。王可等[7]的研究表明，COPD患者的黏膜下腺AQP-5較對照組表達降低，氣道上皮分泌的哮喘氣道黏蛋白（MUC5AC）以及黏膜下腺分泌的黏蛋白較對照組均增加，且AQP-5的表達與MUC5AC和黏蛋白的分泌具有負相關(guān)關(guān)系，提示AQP-5可能參與了COPD患者氣道黏液分泌。

NE可使腺體分泌增多，纖毛上皮細胞受損，還能誘導(dǎo)白細胞介素-8（IL-8）的分泌，或分解激肽釋放酶原使激肽釋放酶具有活性，放大炎癥反應(yīng)。另外，NE可增強病原菌與上皮細胞間的黏附力，使感染容易發(fā)生，還可降低補體或抗體的調(diào)理作用，降低病原菌的清除率，并且是目前已知的促黏蛋白生成和分泌的最強刺激因子，并呈時間依賴性增加氣道黏蛋白的表達[16]。NE能夠消化、降解細胞外基質(zhì)和上皮連接結(jié)構(gòu)造成氣道上皮完整性破壞和肺組織損傷，并通過促進炎性細胞聚集，引起黏液高分泌等機制促使慢性阻塞性肺疾病氣道炎癥與重構(gòu)的發(fā)生[17]。

本實驗結(jié)果表明，清肺化痰膠囊治療COPD，其機制在于能調(diào)節(jié)AQP-5的表達，調(diào)節(jié)黏蛋白分泌，抗炎癥反應(yīng)，抑制NE的表達，調(diào)節(jié)蛋白酶-抗蛋白酶失衡，從而改善黏液高分泌狀態(tài)，起到緩解COPD臨床癥狀、促進排痰、提高生活質(zhì)量的目的。本實驗設(shè)計中還存在不足，比如所用大鼠數(shù)量少，兩組實驗數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析未完成。最后，因中藥的多靶點效應(yīng)，清肺化痰膠囊調(diào)節(jié)大鼠氣道上皮APQ-5表達的作用途徑尚不明確，有待更進一步探索研究。

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