何旭孔，邢增濤，饒欽雄，趙曉燕*，趙明文

1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所;2農(nóng)業(yè)部食用菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，上海201403;3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095

HPLC法測(cè)定香菇中有機(jī)酸含量的檢測(cè)技術(shù)研究

何旭孔1，2，3，邢增濤1，2，饒欽雄1，2，趙曉燕1，2*，趙明文3

1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所;2農(nóng)業(yè)部食用菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，上海201403;3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定香菇中酒石酸、蘋(píng)果酸、乙酸和檸檬酸的方法。在酸提條件下，利用Agela Venusll MP C18色譜柱，以2%CH3OH-20 mM(NH4)2HPO4(pH 2.40)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。四種有機(jī)酸均在8 min內(nèi)出峰。本法準(zhǔn)確、可靠、快速、簡(jiǎn)便，檢出限較低，適合于大批量樣品的分析與檢測(cè)。

HPLC;香菇;酸提;有機(jī)酸

有機(jī)酸廣泛存在于各種農(nóng)產(chǎn)品中，其種類(lèi)和含量直接影響農(nóng)產(chǎn)品口感、風(fēng)味和色澤，也是農(nóng)產(chǎn)品成熟度、加工性以及耐儲(chǔ)藏性的重要依據(jù)［1］，因此測(cè)定食用菌中有機(jī)酸的種類(lèi)和含量具有重要意義。目前測(cè)定有機(jī)酸的方法包括離子色譜法、高效液相色譜法［2，3］和氣相色譜法。高效液相色譜法操作較簡(jiǎn)單［4］，對(duì)于不易衍生化的有機(jī)酸可以直接測(cè)定。

目前，采用HPLC測(cè)定各種植物及果汁中有機(jī)酸的報(bào)道較多［5，6］，而香菇中有機(jī)酸的分離與測(cè)定未見(jiàn)有報(bào)道。由于不同農(nóng)產(chǎn)品含有不同的基質(zhì)，提取有機(jī)酸的方法也不一樣。因此，本研究?jī)?yōu)化有機(jī)酸的提取方法條件和色譜檢測(cè)方法條件，以建立能快速、簡(jiǎn)便和高效的測(cè)定香菇中有機(jī)酸的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

香菇(Lentinus edodes)樣品:2011年6月采集于浙江省磐安縣食藥用菌研究所，將香菇切成薄片，60℃烘干，粉碎，儲(chǔ)存于干燥器中備用。

1.2 儀器與試劑

高壓液相色譜儀(Waters 2695 Separations Module，Waters)，Waters 2487紫外檢測(cè)器(Waters)，純水儀(PURELAB Ultra，ELGA)，電熱恒溫振蕩水槽(DKZ-2型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，離心機(jī)(SORVALL Biofuge stratos)。

甲醇(色譜純，Merck KgaA，Germany)，酒石酸(99.5%)、蘋(píng)果酸(99.5%)、乙酸(99.7%)、一水檸檬酸(99.5%)標(biāo)準(zhǔn)品(D-86199 Augsburg，Germany)，鹽酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(分析純，阿拉丁試劑)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg酒石酸、蘋(píng)果酸、乙酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水溶解并準(zhǔn)確定容至10 mL，制成有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液(濃度為1.0 mg/mL)。再用超純水將儲(chǔ)備液稀釋成濃度為1、5、10、50、100、150、200和250 mg/L的單標(biāo)和混標(biāo)工作溶液，待上樣。

1.4 色譜條件優(yōu)化

色譜條件:Agela Venusll MP C18色譜柱(4.6× 250 mm，5 μm);流動(dòng)相:2%CH3OH-(NH4)2HPO4;柱溫:35℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。對(duì)流動(dòng)相中(NH4)2HPO4水溶液濃度(10、20、50 mM)及pH(2.40、2.60、2.80)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的色譜條件。

1.5 樣品前處理方法優(yōu)化

1.5.1 提取溶劑的篩選

1.5.1.1 水提:準(zhǔn)確稱(chēng)取香菇子實(shí)體粉末0.5 g，加入30 mL蒸餾水于50 mL離心管中，60℃水浴震蕩提取30 min，冷卻至室溫。然后10000 rpm離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定［7］。按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行分析。1.5.1.2 醇提:準(zhǔn)確稱(chēng)取香菇子實(shí)體粉末0.5 g，加入30 mL 80%乙醇于50 mL離心管中，60℃水浴震蕩提取30 min，冷卻至室溫。然后10000 rpm離心10 min，取10 mL上清液于小燒杯內(nèi)，70℃水浴蒸發(fā)除去乙醇，殘留物用流動(dòng)相轉(zhuǎn)入至刻度試管內(nèi)，用流動(dòng)相定容至10 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定［1，8］。按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行分析。

1.5.1.3 酸提:準(zhǔn)確稱(chēng)取香菇子實(shí)體粉末0.5 g，加入0.1 mol/L HCl溶液于50 mL離心管中，60℃水浴震蕩提取30 min，冷卻至室溫。然后10000 rpm離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定［9］。按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行分析。

1.5.2 料液比的篩選

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菇子實(shí)體粉末0.1 g，分別加入5、10、15和20 mL 0.1 mol/L HCl溶液于50 mL離心管中，60℃水浴震蕩提取60 min，冷卻至室溫。然后10000 rpm離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菇子實(shí)體粉末0.1 g，加入15 mL 0.1 mol/L HCl溶液于50 mL離心管中，60℃水浴震蕩分別提取15、30、45和60 min，冷卻至室溫。后續(xù)操作同1.5.2。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取濃度為1、5、10、50、100、150、200和250 mg/L的混標(biāo)工作溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，進(jìn)樣量為10 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取200 mg/L的混標(biāo)工作溶液，按優(yōu)化后的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。

1.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批香菇樣品，按優(yōu)化后的提取方法平行制備樣品液5份，分別進(jìn)樣，測(cè)定各種有機(jī)酸含量，計(jì)算RSD。

1.6.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取新鮮配制的200 mg/L混標(biāo)工作溶液，按優(yōu)化后的色譜條件于0、5、10、15和20后分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。

1.6.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

以香菇干樣為基質(zhì)，分別在不同水平下(見(jiàn)2.3.3)添加有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，按優(yōu)化后的提取方法和色譜條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

1.7 香菇樣品中有機(jī)酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菇粉末0.1 g，按優(yōu)化后的方法制備樣品液，并按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

利用Agela Venusll MP C18色譜柱，以20 mmol/ L磷酸二氫銨(pH 2.40)-甲醇(98∶2，V/V)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃時(shí)，酒石酸、蘋(píng)果酸、乙酸、檸檬酸的峰形與分離度較好。當(dāng)磷酸二氫銨水溶液濃度為10 mmol/L時(shí)，四種有機(jī)酸的分離度相對(duì)較差，當(dāng)磷酸二氫銨水溶液濃度為20和50 mmol/L時(shí)，四種有機(jī)酸的分離度均較好，但考慮到高濃度鹽緩沖溶液影響柱子使用壽命，因此選用20 mmol/L磷酸二氫銨水溶液。另外磷酸二氫銨水溶液pH對(duì)四種有機(jī)酸的分離度和保留時(shí)間也有較大的影響。隨著pH值升高，保留時(shí)間減少，分離度也變差。酒石酸保留時(shí)間最短，容易與樣品中最先被洗脫下來(lái)的雜質(zhì)混在一起而不能分開(kāi)。因此選用較低的pH值，為2.40。

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of organic acids standards

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

由于不同提取溶劑對(duì)香菇中不同物質(zhì)具有不同的溶出作用。用蒸餾水和乙醇提取時(shí)，四種有機(jī)酸的提取效果并不是很好，容易受到雜質(zhì)的干擾(圖3和圖4)。而用低濃度鹽酸溶液提取時(shí)，各種有機(jī)酸受到雜質(zhì)的干擾比較小(圖2)。因此選用低濃度鹽酸溶液作為提取溶劑。

不同料液比和提取時(shí)間均會(huì)影響香菇樣品中有機(jī)酸的提取率。圖5顯示不同料液比對(duì)香菇中有機(jī)酸提取量的影響。但料液比為1∶100時(shí)，有機(jī)酸的提取量比較穩(wěn)定，隨著料液比的繼續(xù)增加，有機(jī)酸含量無(wú)明顯變化，因此料液比選為1∶100。圖6顯示提取時(shí)間對(duì)香菇中有機(jī)酸提取量的影響?？梢钥闯?，檸檬酸提取量受提取時(shí)間影響比較大。在15 min至60 min內(nèi)，酒石酸、蘋(píng)果酸、乙酸含量無(wú)明顯變化，檸檬酸含量不斷上升。綜合各種有機(jī)酸的提取效率，選用60 min作為最佳的提取時(shí)間。

圖5 料液比對(duì)有機(jī)酸含量的影響Fig.5 Effect of sample-solvent ratio on organic acids contents

圖6 提取時(shí)間對(duì)有機(jī)酸含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on organic acids contents

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將系列濃度1～250 mg/L的有機(jī)酸混標(biāo)工作溶液，在優(yōu)化的色譜條件下測(cè)得峰面積，以峰面積對(duì)濃度作圖，得到有機(jī)酸的工作曲線。以信噪比S/N=3所對(duì)應(yīng)的濃度確定檢測(cè)下限。線性回歸方程和檢測(cè)限如表1。

表1 線性回歸方程和檢測(cè)限Table 1 Regression equations and detection limits

2.3.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

各種有機(jī)酸的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD分別為:酒石酸1.08%、2.78%、2.28%;蘋(píng)果酸0.94%、2.00%、0.25%;乙酸 1.16%、1.84%、0.37%;檸檬酸1.05%、2.22%、1.02%。該結(jié)果表明所建立的HPLC檢測(cè)方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好。

2.3.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

加樣回收率見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酒石酸、蘋(píng)果酸、乙酸的平均加樣回收率均在90%以上，而檸檬酸偏低，為83.87%。

表2 有機(jī)酸的回收率Table 2 Recovery rates of organic acids

15.00 29.64 94.92 30.00 43.82 94.75乙酸Acetic acid 9.08 5.00 13.62 90.79 91.80 15.00 23.07 93.29 30.00 36.48 91.32檸檬酸Citrate acid 70.21 36.57 99.66 80.53 83.87 73.14 132.34 84.95 109.72 164.71 86.13

2.4 香菇樣品中有機(jī)酸含量

采樣優(yōu)化的提取方法和色譜條件測(cè)定香菇中各種有機(jī)酸的含量(見(jiàn)表2)，酒石酸為5.98±0.10 mg/g，蘋(píng)果酸為15.40±0.07 mg/g，乙酸為9.08± 0.40 mg/g，檸檬酸為71.21±0.53 mg/g?？梢?jiàn)，香菇中檸檬酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它三種有機(jī)酸。

3 討論

不同提取溶劑對(duì)香菇中的有機(jī)酸和其它基質(zhì)有不同的溶出效果。為了有效的提取有機(jī)酸和排除其它基質(zhì)的干擾，需要找出合適的提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)中，用低濃度鹽酸溶液作為提取溶劑可以很好的達(dá)到這一效果。在酸提條件下，對(duì)有機(jī)酸的提取時(shí)間和料液比進(jìn)行了優(yōu)化，并確定提取時(shí)間為60 min，料液比為100∶1。

流動(dòng)相緩沖液中不同鹽濃度和pH可以影響有機(jī)酸的分離效果。本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定4中有機(jī)酸的色譜條件為:Agela Venusll MP C18色譜柱，2%甲醇-20 mmol/L磷酸二氫銨(pH 2.40)作為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，4中有機(jī)酸得到了很好的分離。另外對(duì)有機(jī)酸的色譜條件進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明色譜條件的線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及回收率都很高。該色譜條件的建立適用于大批香菇樣品中有機(jī)酸的檢測(cè)與分析。

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8 Standardization administration of the people’s republic of china(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)).GB/T 5009.157-2003 Determination of organic acid in foods(GB/T 5009.157-2003食品中有機(jī)酸的測(cè)定).Beijing:Standards Press of China，2003.315-319.

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Determination of Organic Acids in Lentinus edodes by HPLC

HE Xu-kong1，2，3，XING Zeng-tao1，2，RAO Qin-xiong1，2，ZHAO Xiao-yan1，2*，ZHAO Ming-wen31Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Science;2Supervision and Testing Center for Edible Fungi Quality，Ministry of Agriculture，Shanghai 201403，China;3College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

In this experiment，an HPLC method for determination of organic acids in Lentinus edodes was developed.These organic acids contained tartrate acid，malic acid，acetic acid and citrate acid.Under acid extraction，Agela Venusll MP C18column was used at 35℃ and mobile phase was 2%CH3OH-20 mM(NH4)2HPO4(pH2.40)，with the flow rate of 1.0 mL/min.Detection wavelength was 210 nm.Four organic acids were well separated in 8 minutes.The method is accurate，reliable，rapidly and simple with low detection limit.It is suitable for the analysis and determination of samples in large quantity.

HPLC;Lentinus edodes;acid extraction;organic acids

1001-6880(2012)10-1444-05

2011-12-29 接受日期:2012-04-18

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009BADB7B06)

*通訊作者 Tel:86-21-62202832;E-mail:cindy8119@163.com

TS207.3

A