張 媛，李 建，彭小兵，劉軼秋，王 楠，李旭妮

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

細(xì)菌分型的目的是分析流行病學(xué)上相關(guān)的菌株是否來源于單一親代菌株的克隆擴(kuò)增，區(qū)別于流行病學(xué)上無關(guān)菌株的特征構(gòu)成了分型的依據(jù)[1]。一種理想的分型方法應(yīng)是高分辨率、可重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)化、快速簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、良好的分型(指某種分型方法對(duì)病原體分析可得到陽(yáng)性結(jié)果的能力)，并已成功地用于流行病學(xué)調(diào)查[1-2]。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)是一個(gè)具有高重復(fù)性和高分辨率的細(xì)菌分子定型的工具，現(xiàn)已成為分子流行病學(xué)研究技術(shù)上的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。1996年，美國(guó)疾病控制中心和公眾健康實(shí)驗(yàn)室協(xié)會(huì)建立了脈沖網(wǎng)，用于監(jiān)測(cè)食源性微生物。2004年9月，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所牽頭，在北京成立了中國(guó)脈沖網(wǎng)。該監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)為跨地區(qū)病例的病原分析提供了比較平臺(tái)，便于快速比對(duì)搜尋分子分型上一致或高度相似的型別，從而為發(fā)現(xiàn)傳播流行和溯源提供線索和提示。中國(guó)脈沖網(wǎng)主要收錄的是人類病原微生物的脈沖圖譜，對(duì)于動(dòng)物病原微生物的流行病學(xué)調(diào)查許多工作者也在采用PFGE的方法進(jìn)行研究，但還沒有形成規(guī)?；木W(wǎng)絡(luò)。

大腸埃希氏菌病是一類重要的人畜共患病，在國(guó)內(nèi)外均普遍發(fā)生，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極其嚴(yán)重，可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病等病型?！吨袊?guó)獸醫(yī)菌種目錄》中收錄的致病性大腸埃希氏菌，其背景資料涵蓋菌株歷史(包括菌株來源、別號(hào)、原學(xué)名及菌株的分離)，菌株的主要特性(包括菌株的毒性、毒力、抗原性、免疫原性、培養(yǎng)特性、模式株或參考株、血清型等)，菌株的用途(包括用于制造疫苗、檢驗(yàn)疫苗等)，參考文獻(xiàn)，培養(yǎng)基及生長(zhǎng)條件等，但是沒有涉及菌株基因分型的數(shù)據(jù)。本研究利用PFGE方法建立了《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》收錄的127株致病性大腸埃希氏菌的電泳圖譜，完善了《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》中致病性大腸埃希氏菌背景資料，使其具有更大的參考價(jià)值，也為進(jìn)一步探討大腸埃希氏菌基因分型與血清學(xué)分型及菌株致病性之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系提供了有意義的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 致病性大腸埃希氏菌 127株致病性大腸埃希氏菌，由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 質(zhì)控菌株 大腸桿菌ATCC18785，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.4 試劑 低熔點(diǎn)瓊脂糖(Seakem Gold瓊脂糖)、蛋白酶 K、限制性內(nèi)切酶(XbaⅠ酶，10 U/μL)、10 ×H Buffer，購(gòu)自美國(guó) Promega 公司。三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、十二烷基肌氨酸鈉(N-Lauroyl Sarcosine sodium)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自Amresco公司。溴化乙錠儲(chǔ)液(EB，10 mg/mL)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。HCl、Na2EDTA·2H2O、NaOH、硼酸，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DKB-8A型電熱恒溫水槽，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。CHEF-DR III型脈沖電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，購(gòu)自上海雷磁儀器廠。電子天平購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。THZ-C型恒溫振蕩器購(gòu)自太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。Herasafe KS生物安全柜購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司。移液槍購(gòu)自法國(guó)Gilson公司。

1.2 方法

1.2.1 制備細(xì)菌懸液 開啟菌種，在麥康凱瓊脂平皿上劃線培養(yǎng)。刮取細(xì)菌，懸濁于CSB中。測(cè)定610 nm處OD值，調(diào)整濃度至1.4～1.5。

1.2.2 制備膠 在調(diào)整好菌液濃度的每個(gè)試管中加入10 μL蛋白酶K儲(chǔ)存液(20 mg/mL)，每個(gè)菌液均吸出200 μL加到離心管中，向加有菌液的離心管中加入200 μL已融化的含1%Seakem Gold瓊脂糖及1%SDS的TE?；靹蚝蠹拥侥＞咧?，將膠放在室溫10～15 min以使其凝固。

1.2.3 裂解膠 每個(gè)樣品需使用5 mL CLB，每5 mL CLB加入25 μL蛋白酶K儲(chǔ)存液(20 mg/mL)，每個(gè)試管中均加入5 mL此混合液，將每個(gè)樣品制備的膠移入相應(yīng)的試管中，確保膠塊在液面下。在54℃搖床中孵育2 h，轉(zhuǎn)速200 r/min，裂解完成立即洗膠。

1.2.4 洗膠 每個(gè)管中加15 mL預(yù)熱的純水，置50℃搖床中振蕩15 min(200 r/min)。將水倒掉，每個(gè)管中再加15 mL預(yù)熱的純水，置50℃搖床中振蕩30 min(200 r/min)。將水倒掉，每個(gè)管中加15 mL預(yù)熱的TE，置50℃搖床中振蕩15 min(200 r/min)。再用TE重復(fù)洗3次，一共用TE洗4次。將TE倒掉，把膠移到裝有2 mL室溫TE的試管中，置4℃存放。

1.2.5 酶切 用刀片將膠的邊緣裁直后切成4～4.5 mm厚的膠層，將膠層放到裝有200 μL 1×H Buffer的離心管中，確保膠層在液面下，置37℃孵育10 min后，將緩沖液吸出。每個(gè)管中加入200 μL酶切溶液(174 μL 純水，20 μL 10 ×H Buffer，4 μL XbaⅠ酶，2 μL BSA)，37 ℃孵育4 h后置4 ℃存放。

1.2.6 加樣 將離心管底的緩沖液吸出，加入200 μL 0.5×TBE Buffer，室溫孵育5 min后，把膠塊加在梳子齒上，室溫下風(fēng)干10 min。把梳子放入膠槽，倒入100 mL融化的54℃ 1%Seakem Gold瓊脂糖，室溫下凝固30 min。移走梳子，在膠孔中倒入融化的54℃ 1%Seakem Gold瓊脂糖，凝固5 min。

1.2.7 電泳 0.5×TBE Buffer制冷至14℃，取出凝固好的膠放入電泳槽，設(shè)置電泳條件為:角度120°，脈沖切換時(shí)間為2.2～54.2 s，電泳時(shí)間19 h，電壓6 V/cm，溫度14℃。

1.2.8 染色、脫色、拍照 400 mL純水中加入25 μL EB(10 mg/mL)對(duì)膠塊震蕩染色30 min(40 r/min)，再用400 mL純水震蕩脫色30 min，再重復(fù)脫色1次，拍攝圖像。

1.2.9 分析 將結(jié)果用Bio-Rad公司的Info Quest FP聚類分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 127株致病性大腸埃希氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜的建立 圖1為部分大腸埃希氏菌經(jīng)PFGE分離，EB染色后的圖譜。圖1中大腸埃希氏菌的背景信息如表1所示。用Info Quest FP分析軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，用10～3000 Kb的標(biāo)尺表示出每株大腸埃希氏菌DNA條帶的位置，部分大腸埃希氏菌軟件分析結(jié)果見圖2。將分析結(jié)果輸入《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》相應(yīng)菌株的背景資料中，部分大腸埃希氏菌目錄如圖3所示。

圖1 部分大腸埃希氏菌的PFGE結(jié)果

表1 部分致病性大腸埃希氏菌背景信息

圖3 部分大腸埃希氏菌目錄

2.2 127株致病性大腸埃希氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果分析 用聚類分析軟件對(duì)127株大腸埃希氏菌電泳結(jié)果進(jìn)行分析，分析結(jié)果以百分比率的形式展示出來，百分比越大說明不同菌株之間的親緣關(guān)系越近;反之親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。Tenover等[4]認(rèn)為由于細(xì)菌具有變異性，在PFGE圖譜分析中相似率在85%以上的菌株可以判斷是流行病學(xué)相關(guān)。從表2可以看出，流行病學(xué)相關(guān)的致病性大腸埃希氏菌O抗原、K抗原、H抗原血清型均相同;采樣部位相同;致病性相同。但O抗原、K抗原血清型均相同的大腸埃希氏菌流行病學(xué)不一定相關(guān)，如從西寧分離的CVCC227和江蘇農(nóng)科院送藏的CVCC226血清型均為O8∶K87，K88ac，但PFGE電泳圖譜相似率只有75.8%。血清型不同的大腸埃希氏菌流行病學(xué)不相關(guān)。

表2 流行病學(xué)相關(guān)的致病性大腸桿菌比較

3 討論

《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》對(duì)獸醫(yī)科研工作者、教學(xué)人員和有關(guān)工廠的技術(shù)人員在選擇利用微生物資源時(shí)有直接助益，對(duì)國(guó)際間交流起著橋梁作用。目前《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》收錄的致病性大腸埃希氏菌背景資料中已經(jīng)提供了菌株的血清學(xué)分型結(jié)果，但缺少基因分型數(shù)據(jù)。本課題組將127株致病性大腸埃希氏菌的條帶分子大小補(bǔ)充進(jìn)《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》相應(yīng)菌株的背景資料中，使其具有更大的參考價(jià)值。

曾對(duì)15種O抗原血清型的健康豬大腸埃希氏菌分離株與其相同血清型的大腸埃希氏菌致病株的脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明任何相同血清型的健康豬大腸埃希氏菌分離株和大腸埃希氏菌致病株沒有流行病學(xué)相關(guān)性。這個(gè)結(jié)果提示，大腸埃希氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜很可能與其致病性有關(guān)[5]。

大腸埃希氏菌O抗原血清型鑒定在診斷和流行病學(xué)調(diào)查中被廣泛應(yīng)用。本研究對(duì)127株致病性大腸埃希氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜聚類分析結(jié)果表明，O抗原血清型相同的菌株流行病學(xué)不一定相關(guān)，但流行病學(xué)相關(guān)的菌株O抗原血清型一定相同。這個(gè)結(jié)果一方面說明了基因分型比表型分型更細(xì)致，同一表型的菌株又可劃分為不同的基因型;另一方面也在提示大腸埃希氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜與致病性之間的相關(guān)性。大腸埃希氏菌的致病性除與O抗原有一定關(guān)系外，主要還取決于K抗原。K抗原是菌體表面的一種熱不穩(wěn)定性抗原，多存在于被膜或莢膜中，個(gè)別位于菌毛中。致病性大腸埃希氏菌除含酸性多糖K抗原外，還含有蛋白質(zhì)粘附素抗原，粘附素是大腸埃希氏菌致病的主要毒力因子[6]。但致病性不是決定脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜的唯一因素，因?yàn)檠芯拷Y(jié)果表明O抗原、K抗原血清型及致病性均相同的大腸埃希氏菌流行病學(xué)不一定相關(guān)。

本研究127株大腸埃希氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜收錄于《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》中，可供研究者進(jìn)行比對(duì)，盡管不能像脈沖網(wǎng)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行電子比對(duì)，但康梅等[7]提供了一個(gè)人工比對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)，即酶切圖譜差異3個(gè)條帶以上者為不同類型，3個(gè)條帶及以下者為同一型的不同亞型。認(rèn)為同一型的各亞型間在基因上有相關(guān)性，而不同類型的菌株在流行病學(xué)上無相關(guān)性。如果分離株與《中國(guó)獸醫(yī)菌種目錄》中收錄的菌株為同一型，可能具有相同的致病性。實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行圖譜的比對(duì)必須保證使用相同的方法、試劑、儀器及電泳條件。

[1]Robert C，Aber M D，Donald C，et al.Epidemiologic typing of nosocomial microoganism[J].Am J Med，1981，70:899-905.

[2]Joel N Maslow，Maury Ellis Mulligan，Robert D Arbeit.Molecular epidemiology:application of contemporary techniques to the typing of microorganisms[J].Clin Infect Dis，1993，17:153-164.

[3]Pfaller M A，Wendt C，Hollis R J，et al.Comparative evaluation of an automated ribotyping system versus pulsed-field gel electrophoresis for epidemiological typing of clinical isolates of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa from patients with recurrent gram-negative bacteremia[J].Diagn Microbiol Infect Dis，1996，25:1-8.

[4]Fred C Tenover，Robert D Arbeit，Richard V Goering，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing[J].Journal of Clinical Microbiology，1995，33(9):2233-2239.

[5]張 媛.規(guī)模化豬場(chǎng)80株大腸桿菌的耐藥性、血清型與脈沖場(chǎng)電泳分型[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[6]De Graaf F K，Klemm P，Gaastra W.Purification，characterization，and partial covalent structure of Escherichia coli adhesive antigen K99[J].Infect Immun，1990，58:1858-1870.

[7]康 梅，申艷娜.脈沖場(chǎng)凝膠電泳在醫(yī)院內(nèi)感染大腸桿菌的分子流行病學(xué)的應(yīng)用研究[J].華西醫(yī)學(xué)，2002，17(1):34-35.