羅羽洧 解衛(wèi)華 馬 娟 郁志蕓

不同發(fā)芽條件對蠶豆植酸酶活性的影響

羅羽洧1解衛(wèi)華2馬 娟1郁志蕓1

(金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院1，南京 210038)
(環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所2，南京 210042)

以蠶豆為試材，研究發(fā)芽過程中植酸酶在蠶豆不同部位的變化和性質(zhì)。發(fā)芽蠶豆不同部位植酸酶活性呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢，子葉植酸酶在發(fā)芽第6天達(dá)最高值。超聲波處理對發(fā)芽蠶豆胚根、子葉和胚芽植酸酶活性有一定促進(jìn)作用，其中以15 min超聲波處理對胚根和胚芽植酸酶活性影響最大，5 min處理、10 min處理和15 min處理均對子葉植酸酶活性有顯著影響。在發(fā)芽過程中不同光照對蠶豆進(jìn)行處理，不論胚根、子葉還是胚芽，黑暗處理植酸酶活性高于光照處理。核酸抑制劑放線菌素(Act－D)和蛋白質(zhì)抑制劑環(huán)已酰胺(CHM)對發(fā)芽蠶豆胚根、子葉和胚芽中的植酸酶活性有一定影響，其中以CHM的抑制效果最為明顯。

蠶豆 發(fā)芽 植酸酶

植酸酶，又稱肌醇六磷酸水解酶，廣泛存在于動植物組織和微生物［1－2］。目前分離的植酸酶主要有兩種:3－植酸酶和6－植酸酶，前者主要存于動物和微生物;后者主要存于植物組織［3－4］。

蠶豆發(fā)芽過程中，植酸酶降解植酸鹽，釋放出來的無機磷、磷酸肌醇和其他金屬離子可供蠶豆生長所用［5－6］。蠶豆中的植酸磷占總磷含量的80%，無機磷在蠶豆發(fā)芽過程中起著重要作用，細(xì)胞膜合成，DNA和RNA合成都需要無機磷的參與［7］。植酸或植酸鹽降解生成的三磷酸肌醇是重要的第2信使，它感應(yīng)外部環(huán)境各種刺激來調(diào)節(jié)蠶豆的生理反應(yīng)［8］。同時，植酸鹽還結(jié)合很多金屬離子，如Mg2+、Ca2+等，這些離子在蠶豆發(fā)芽過程中也起著重要的生化作用。如Mg2+、Ca2+是很多種蛋白酶的激活劑，同時Ca2+還是生物體內(nèi)重要的第2信使，這些金屬離子只有從植酸鹽中釋放出來才能發(fā)揮作用［9－11］。植酸酶在蠶豆萌發(fā)過程中對自身營養(yǎng)成分利用起到重要作用，因此蠶豆植酸酶活性的高低，對蠶豆發(fā)芽有重要的意義［12－14］。

蠶豆植酸酶活性受到多種外界因素影響，如溫度、pH、發(fā)芽時間等。這些因素對植酸酶活性的影響先前已有很多報道［15－17］，如植酸酶的最適溫度為50～55℃，最佳pH 5．5，植酸酶活性大小與發(fā)芽時間長短有關(guān)［15，18－19］。但超聲波和光照處理對發(fā)芽蠶豆植酸酶活性影響目前沒有報道。關(guān)于植酸酶的來源，報道的說法不一。研究表明，植酸酶存在于豆科籽粒本身，在發(fā)芽過程中被激活發(fā)揮作用［20］;另外也有研究表明，籽粒本身不存在植酸酶，豆類作物在發(fā)芽過程中，植酸酶來源于從頭合成［2］;還有學(xué)者認(rèn)為植酸酶有兩種來源［21］。本研究分析了不同發(fā)芽條件對蠶豆植酸酶活性的影響，同時就蠶豆在發(fā)芽過程中植酸酶的來源做一初步的探討，為更好利用蠶豆?fàn)I養(yǎng)價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

蠶豆品種為啟豆2號，2010年購于南京種業(yè)有限公司。

1．2 試驗儀器

JA2003型電子天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司;磁力攪拌器:上海司樂儀器廠;WH－3微型旋渦混合儀:上海滬西分析儀器廠;HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國華電器有限公司;SK5200L H型超聲波清洗器:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV－2802型紫外可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1．3 發(fā)芽試驗和樣品處理

選擇均勻一致的蠶豆種子用0．5%次氯酸鈉消毒25 min，再用去離子水反復(fù)沖洗2次。然后放入表面皿中以25℃水浸泡24 h，在25℃條件下發(fā)芽8 d。每24 h取樣一次，把蠶豆的胚根、子葉、胚芽和胚軸剝開，放在聚乙烯袋中分別保存，然后放置于－18℃冰箱中待測。每天換水、換氣2次。每個試驗材料設(shè)置3個重復(fù)［5］。

1．4 植酸酶活性的測定

分別稱取5．000 g發(fā)芽蠶豆樣品，研磨后放入4個100 mL燒杯中(4個重復(fù))，加入50 mL冷卻的醋酸緩沖液，用磁力攪拌器攪拌60 min，然后過濾，定容至100 mL，得到植酸酶粗酶液，置于冰箱中低溫保存?zhèn)溆?。?支已標(biāo)號的10 mL刻度試管，其中1管作空白對照，其他3管為反應(yīng)管。在4支刻度試管中分別加入3．000 mL植酸鈉溶液，置于37℃水浴鍋預(yù)熱5 min，然后以相同時間間隔(間隔為0．5 h)依次在反應(yīng)管中加入已預(yù)熱的植酸酶溶液1．000 mL，在37℃水浴鍋中溫育1 h，按與加入酶液相同順序和時間間隔加入4．000 mL釩鉬酸銨顯色/終止液，空白管加入1．000 mL植酸酶溶液，混合搖勻，用分光光度計在415 nm處比色(以空白管作對照)讀取吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算植酸酶活性。每分鐘水解釋放1μmol無機磷為1個活性單位(1 u)。

1．5 超聲波處理

超聲波處理:用蒸餾水浸泡蠶豆24 h，然后將各處理蠶豆樣品用紗布包裹，懸于超聲波清洗器水槽中，按規(guī)定時間準(zhǔn)確處理，介質(zhì)為16～18℃蒸餾水。放入SK5200L H型超聲波清洗器(工作頻率59 kHz，功率200 W)中進(jìn)行處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。處理時間:對照:0 min，處理1∶5 min，處理2∶10 min，處理3∶15 min，處理4:20 min［22］。

1．6 光照處理

設(shè)置兩個光照處理類型。光照處理:12 h光照+12 h黑暗;黑暗處理:24 h黑暗處理。

1．7 核酸抑制劑和蛋白質(zhì)抑制劑處理

藥劑吸脹處理:處理方法基本同上，僅在種子吸脹階段進(jìn)行如下處理:分別在50 mg/L Act－D(放線菌素，核酸合成抑制劑)和20 mg/L CHM(環(huán)己酰亞胺，蛋白質(zhì)合成抑制劑)溶液中吸脹。吸脹處理24 h后，傾去多余溶液繼續(xù)在暗中萌發(fā)。萌發(fā)120 h后檢測胚根、子葉和胚芽植酸酶的活性［23］。

2 結(jié)果與分析

2．1 植酸酶在發(fā)芽蠶豆不同部位的分布特點

從圖1可看出，胚根植酸酶活性在發(fā)芽前5天是逐漸增加，發(fā)芽第5天達(dá)到最大峰值170．2 u/g。從第6天開始，蠶豆植酸酶活性逐步降低，但酶活性仍比發(fā)芽前4天要高。

圖1 植酸酶活性在胚根中含量的變化

從圖2的結(jié)果可以看出，子葉中植酸酶活性大于胚根中的活性(P＜0．01)。子葉在剛開始發(fā)芽的時就具有一定的酶活，隨發(fā)芽時間的延長，植酸酶活性增加顯著，但發(fā)芽到第5天達(dá)到酶活性峰值，隨后逐步下降。植酸酶活性在子葉和胚根中的變化類似。

圖2 植酸酶活性在子葉中含量的變化

圖3 表示胚芽中植酸酶活性的變化情況。胚芽中植酸酶活性變化蠶豆的發(fā)芽階段變化平緩，發(fā)芽第6天達(dá)到酶活性的高峰，然后緩慢下降。值得注意的是，胚芽在發(fā)芽的初期就具備一定酶活性，這與子葉的情形很相似，因此可推斷，在胚芽和子葉中本身就存在一定含量的植酸酶，浸泡處理可激活植酸酶而表現(xiàn)出一定活性，這與胚根中植酸酶來源不同，胚根中植酸酶活性可能來至于新合成植酸酶或來至從子葉運輸過來的植酸酶。

圖3 植酸酶活性在胚芽中含量的變化

圖4表示蠶豆胚軸中植酸酶活性的變化情況。胚軸植酸酶活性變化趨勢是逐漸減少，在發(fā)芽的第4天就基本檢測不來。

圖4 植酸酶活性在胚軸中含量的變化

2．2 超聲波處理對發(fā)芽蠶豆植酸酶活性的影響

圖5～圖7表示超聲波處理對發(fā)芽蠶豆胚根、子葉和胚芽植酸酶活性的影響。從圖5可以看出，處理1、處理2和處理3對發(fā)芽蠶豆胚根植酸酶活性有激活作用，并且差異顯著(P＜0．05)，其中以處理3的效果最好，但是處理1、處理2和處理3之間差異不顯著(P!0．05)。從圖6可以看出處理1、處理2和處理3均對子葉植酸酶的活性有顯著影響(P＜0．05)，而處理4和對照相比，差異不顯著(P!0．05)。但是處理1、處理2和處理3之間差異不顯著(P!0．05)。這和胚根中植酸酶的情況類似。圖7可以看出處理1、處理2和處理3均對胚芽植酸酶的活性有顯著影響(P＜0．05)，與處理4相比差異顯著(P＜0．05)。

超聲波是頻率大于20 kHz的機械振動在介質(zhì)中傳播的彈性波，能在介質(zhì)中引起空化效應(yīng)，熱效應(yīng)和機械效應(yīng)，適當(dāng)強度的超聲波作用于生物組織，將會活化生物物質(zhì)，調(diào)節(jié)新陳代謝，最終表現(xiàn)出人們預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)［24－25］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)強度超聲波處理可增強細(xì)胞膜的透性，促進(jìn)生物酶的催化活性。一般認(rèn)為較低的超聲波功率對酶起激活作用，大功率的超聲波會讓酶失活。超聲波對一種酶的酶促反應(yīng)究竟有何影響，要看不同的參數(shù)和試驗條件而定，并不能一概而論［26－27］。

圖5 超聲波處理對發(fā)芽蠶豆胚根植酸酶活性的影響

2．3 光照處理對發(fā)芽蠶豆不同部位植酸酶活性的影響

從圖8～圖10中可以看出，不論是在胚根、子葉還是胚芽，黑暗處理發(fā)芽蠶豆植酸酶的活性高于光照處理。說明光照對植酸酶活性有一定影響。國外有學(xué)者利用不同類型的光對大豆發(fā)芽過程中植酸酶的活性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光量子能量越大，植酸酶活性越小，光量子能量越小，植酸酶的活性越大。說明光能量大小對植酸酶的活性有影響，究竟是影響其空間結(jié)構(gòu)還是影響其與底物接觸還有待于進(jìn)一步研究［28］。

圖8 光照和黑暗處理對發(fā)芽蠶豆胚根中植酸酶活性的影響

2．4 核酸抑制劑和蛋白質(zhì)抑制劑對發(fā)芽蠶豆植酸酶活性的影響

從圖11可看出，不論是核酸抑制劑(Act－D)還是蛋白質(zhì)抑制劑(CHM)都對發(fā)芽蠶豆胚根、子葉和胚芽中的植酸酶活性有一定影響，其中以蛋白的抑制效果最為明顯(P＜0．05)，發(fā)芽5 d后，蛋白質(zhì)抑制劑處理的蠶豆中胚根、子葉和胚芽中植酸酶活性只相當(dāng)于對照處理的24．9%、34．5%和26．7%。從這個結(jié)果我們可以看出，在蠶豆種子發(fā)育成熟候，mRNA在種子內(nèi)已形成并貯存在蠶豆種子中，在種子發(fā)芽的時進(jìn)行翻譯合成植酸酶蛋白質(zhì)。但這部分的mRNA并不是蠶豆種子中植酸酶蛋白質(zhì)的全部，核酸在發(fā)芽過程中同樣要轉(zhuǎn)錄形成部分的mRNA來形成更多的植酸酶供種子發(fā)芽時所需。在國外也有相關(guān)的報道［29］。臺灣大學(xué)有報道表明，在大麥發(fā)芽過程中，觀察到了新植酸酶蛋白質(zhì)譜帶，這說明有新的植酸酶蛋白質(zhì)在發(fā)芽過程中合成［21］。因此可推斷，蠶豆種子萌發(fā)和植酸酶有密切的關(guān)系。也有研究證明，植酸酶水解植酸產(chǎn)生的肌醇三磷酸(簡稱IP3)可作為信息傳遞體打開細(xì)胞器的鈣通道，活化生長素受體因子，形成蛋白質(zhì)—生長素復(fù)合物，活化核內(nèi)特殊mRNA，進(jìn)而生成發(fā)芽所需要的酶類［3，8，30］。蠶豆種子萌發(fā)需要大量磷元素參與，并且蠶豆中80%的磷元素存在于植酸中，植酸能否順利降解對于蠶豆的發(fā)芽至關(guān)重要。

圖11 Act－D和CHM對發(fā)芽蠶豆不同部位植酸酶活性的影響

3 結(jié)論

發(fā)芽蠶豆不同部位植酸酶活性呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢。超聲波處理對發(fā)芽蠶豆胚根和子葉植酸酶活性有一定的影響，其中以處理3對胚根植酸酶活性影響最大，處理1、處理2和處理3均對子葉植酸酶活性有顯著影響。在發(fā)芽過程中用不同的光照對發(fā)芽蠶豆進(jìn)行處理，不論是在胚根、子葉還是胚芽，黑暗處理植酸酶的活性高于光照處理。核酸抑制劑(Act－D)還是蛋白質(zhì)抑制劑(CHM)都對發(fā)芽蠶豆胚根、子葉和胚芽中的植酸酶活性有一定影響，其中以蛋白質(zhì)抑制劑的效果最為明顯。

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Effects of Different Germination Conditions on Phytase Activity on Faba Bean(Vicia faba L．)

Luo Yuwei1Xie Weihua2Ma Juan1Yu Zhiyun1
(College of Horticulture，Jinling Institute of Technology1，Nanjing 210038)
(Nanjing Institute of Environmental Science of Ministry Environmental Protection2，Nanjing 210042)

Phytase activity and property in different faba bean fractions during germination were investigated with faba bean as the testing piece．The phytase activity appeared a change trend of increasing first then decreased with the maximum value at the sixth day during germination in cotyledon．Ultransonic treatments had facilitations on dles．Singel factor experiment was made to modified potato starch，early indica rice flour，water content and scope of steaming time．Carry out the orthogonal experiment with millet rice noodles index weight springiness 0．2，chewiness 0．2，stretchability 0．3，sensory score 0．3，workability 0．3 as the evaluating index of millet rice noodles quality．The test shown the peocessing conditions of millet rice noodles:salt content was 0．4%;sodium pyrophosphate was 0．03%;modified potato starch content was 12%;early indica rice flour was 8%;water content was 60%and steaming time was 6min．And at these conditions，comprehensive evaluation score was 67．205，in whick the sensory score was 8．7，tasting better and noodle gloss better．Then the processing of millet rice noodles was predicted to have certain feasibility．

millet，millet rice noodles，texture properties，processing conditions

TS275．4

A

1003－0174(2012)10－0032－06

江蘇省高校自然科學(xué)基金(11KJD210001)，金陵科技學(xué)院博士科研啟動基金(jit－b－201205)

2012－01－02

羅羽洧，男，1978年出生，副教授，博士，園藝產(chǎn)品貯藏與加工