施少華，傅光華，萬(wàn)春和，程龍飛，陳紅梅，黃振洲，黃 瑜

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州350013；3.廣東省江門市臺(tái)山都斛西敦獸醫(yī)服務(wù)部，廣東 江門529226）

2010年春夏之交，我國(guó)部分地區(qū)種鴨和蛋鴨發(fā)生以突發(fā)產(chǎn)蛋急劇下降為特點(diǎn)一種疾病。研究人員從表現(xiàn)產(chǎn)蛋驟降的病死禽中采集其卵巢、肝臟、腦等進(jìn)行病毒分離，經(jīng)對(duì)所分離的病毒進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、理化特性測(cè)定、RT－PCR檢測(cè)及序列分析明確該病病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）［1－6］。之后相繼有雞和鵝感染TMUV的病例報(bào)告［7－9］。

2011年5～6月，廣東江門的部分養(yǎng)鵝場(chǎng)20～30日齡雛鵝發(fā)病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為搖頭、軟腳，剖檢可見(jiàn)肝臟出血、壞死，個(gè)別有心肌出血等現(xiàn)象。我們從患病鵝中分離到1株病毒，經(jīng)RT－PCR檢測(cè)和序列分析表明該病毒為TMUV。

1 材料與方法

1.1 酶、試劑 Trizol reagent RNA提取液，購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶AMV Reverse Transcriptase、RNA酶抑制劑 Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mix、DNA Marker DL－2 000和pMD18－T載體，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，2×PCR Master Mix，購(gòu)自Fermentas公司，瓊脂糖凝膠回收小量試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，購(gòu)自O(shè)miga公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞自制。

1.2 試驗(yàn)禽胚、試驗(yàn)動(dòng)物及血清 13日齡鵝胚，購(gòu)自廣東江門某孵化場(chǎng)，10日齡番鴨胚購(gòu)自福建莆田某孵化場(chǎng)。3日齡長(zhǎng)樂(lè)灰鵝，購(gòu)自福建長(zhǎng)樂(lè)某養(yǎng)鵝場(chǎng)?？锅員MUV血清由鴨TMUV WR株免疫麻鴨制得。

1.3 病原分離 無(wú)菌采集呈典型病變的雛鵝肝臟，處理后接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基，于37℃有氧或燭缸培養(yǎng)48h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。同時(shí)將雛鵝的肝臟剪碎后按照組織重量1∶4加入滅菌PBS，反復(fù)凍融3次后8 000r／min離心5min，取上清用0.22μm的過(guò)濾器除菌，濾過(guò)液經(jīng)尿囊腔接種13日齡鵝胚6枚，0.2mL／胚；同時(shí)接種滅菌PBS作為對(duì)照。每天觀察3次，棄24h內(nèi)死胚。收集24～120h死亡鵝胚的尿囊液，進(jìn)行無(wú)菌檢查和雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒在番鴨胚的傳代 將鵝胚的尿囊液接種10日齡番鴨胚4枚，0.2mL／胚；同時(shí)接種滅菌PBS作為對(duì)照。每天觀察3次，棄24h內(nèi)死胚，收集24～96 h死亡鴨胚的尿囊液，進(jìn)行無(wú)菌檢查和雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 鴨胚半數(shù)致死量（ELD50）的測(cè)定 將待測(cè)病毒液用滅菌生理鹽水作10－1～10－6稀釋，分別接種于10日齡番鴨胚尿囊腔中，每個(gè)稀釋度接種5枚，每枚0.2mL。每天照蛋2次，24h內(nèi)死亡的鴨胚廢棄不計(jì)，以后每天記錄死亡情況，連續(xù)觀察7d，按Reed－Muench法計(jì)算病毒對(duì)番鴨胚的ELD50。

1.6 中和試驗(yàn) 將新鮮病毒尿囊液按1∶10稀釋，與已知的抗鴨TMUV血清等量混合，并用1∶10病毒液與滅菌生理鹽水等量混合作對(duì)照。混合后置37℃1h，分別接種10日齡鴨胚，每枚0.2mL，每組5枚。每天觀察3次，棄24h內(nèi)死胚，共觀察7d。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將20只3日齡長(zhǎng)樂(lè)灰鵝隨機(jī)分成2組，每組10只。飼養(yǎng)觀察7d后，A組肌肉注射新鮮病毒尿囊液，每只1mL，B組肌肉注射滅菌生理鹽水，每只1mL。隔離飼養(yǎng)，每天觀察2次，連續(xù)觀察14d。

1.8 RT－PCR鑒定及序列分析

1.8.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［10］合成可擴(kuò)增469bp的鴨TMUV NS5基因片段的引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.8.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取病毒株感染的番鴨胚尿囊液于10 000r／min（4℃）離心10min以去除雜質(zhì)，收集上清液參照Trizol reagent說(shuō)明書(shū)操作對(duì)病毒RNA進(jìn)行提取，最后每250μL尿囊液的病毒RNA用5μL DEPC水溶解。反轉(zhuǎn)錄按AMV Reverse Transcriptase說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體如下：將制備好的RNA 5μL，加入200pmol／μL隨機(jī)引物1μL，AMV RT 5×Buffer 4μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 8μL，40U／μL Ribonuclease Inhibitor 1μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL，混勻后按以下程序進(jìn)行RT：42℃60min，99℃5min，保存于4℃。

1.8.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25μL：取2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2× PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，dd H2O補(bǔ)齊至25μL后按以下程序進(jìn)行PCR：95℃變性3min后，94℃變性40s，55.3℃退火40s，72℃延伸40s，共35循環(huán)，最后72℃延伸10 min，保存于4℃。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8.4 其他病原的排除 參照禽流感病毒、禽1型副黏病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨甲肝病毒1型、鴨甲肝病毒3型、番鴨呼腸孤病毒、新致病型鴨呼腸孤病毒基因序列設(shè)計(jì)引物，提取GD06株病毒的核酸，分別進(jìn)行PCR或RT－PCR擴(kuò)增。

1.8.5 克隆測(cè)序 PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12～16h，挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r／min振蕩過(guò)夜，取2μL菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽(yáng)性者送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.8.6 序列比對(duì)分析 將所獲得的測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件包MegAlign程序進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)MEGA 4.0分析遺傳進(jìn)化關(guān)系。參考毒株及其登錄號(hào)：JS804株（JF895923），BYD－1株（JF312912），SD株（JN232077），Huabei株（JF523187），TMUV 14／6／82株（EU303233），以色列火雞腦膜炎病毒（Israel turkey meningoencephalitis virus，ITV）（AF013377）。

2 結(jié)果

2.1 病原分離 從病死鵝肝臟取樣接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)后48h未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，初步排除細(xì)菌感染的可能。病料樣品接種鵝胚后在72h左右死亡，收集死亡鵝胚的尿囊液，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)細(xì)菌污染和病毒無(wú)血凝活性，暫命名為GD06株。

2.2 ELD50的測(cè)定 將待測(cè)病毒液用滅菌生理鹽水作10－1～10－6共6個(gè)稀釋度，分別接種于10日齡番鴨胚尿囊腔中，連續(xù)觀察7d，算出ELD50＝10－1.84／0.2mL。

2.3 中和試驗(yàn) 將新鮮病毒尿囊液按1∶10稀釋，與已知的抗鴨TMUV血清等量混合，置37℃1h，接種鴨胚，第3天有死胚1枚，而1∶10病毒液與滅菌生理鹽水等量混合后接種鴨胚，7d內(nèi)全部死亡。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) A組肌肉注射新鮮病毒尿囊液后死亡2只，剖檢鵝肝臟有出血、壞死，將病變組織勻漿后接種10日齡鴨胚，可致鴨胚死亡，用RT－PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，撲殺其他健活鵝未發(fā)現(xiàn)有明顯的剖檢病變。B組肌肉注射滅菌生理鹽水無(wú)異?，F(xiàn)象。

圖1 鵝TMUV GD06株的RT－PCR／PCR檢測(cè)

2.5 RT－PCR或PCR鑒定 用特異性引物對(duì)GD06株進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1所示，鴨TMUV特異性引物能成功擴(kuò)增出1條約500bp的電泳條帶，且空白對(duì)照無(wú)特異性條帶。其他特異性引物均未能成功對(duì)其擴(kuò)增出目的片段。

2.6 基因序列分析 將所擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行回收純化、克隆測(cè)序，經(jīng)BLASTP檢索可知，所克隆的基因片段與TMUV具有較高的同源性。對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1，分離株GD06與鵝源TMUV JS804株的核苷酸同源性高達(dá)99.8%，與鴨源TMUV（WR株、BYD－1株和SD株）核苷酸同源性分別為99.1%、99.8%和99.8%；與雞源TMUV FQ－C1株的同源性高達(dá)98.5%，而與TMUV 14／6／82株的同源性為88.3%，與ITV的同源性為76.1%（TMUV與ITV的同源性則為74.4%）；氨基酸同源性比較表明，GD06株與BYD－1株、SD株、JS804株和Huabei株的同源性達(dá)100%，與雞源TMUV FQ－C1株的同源性為98.1%，與TMUV的同源性也達(dá)96.8%。如圖2所示，GD06株與鴨源、鵝源和雞源TMUV的遺傳進(jìn)化關(guān)系近，它們共聚為同一分支，但與TMUV和ITV分立不同的進(jìn)化分支。

3 討論

黃病毒是一類具有囊膜的單鏈RNA病毒，包括黃熱病病毒、乙型腦炎病毒、登革熱病毒、坦布蘇病毒、森林腦炎病毒、以色列火雞腦膜炎病毒等。吸血的節(jié)肢動(dòng)物，例如蚊和蜱等是黃病毒屬的主要傳播媒介。

表1 水禽源TMUV毒株之間及其與TMUV和ITV參考毒株之間NS5基因的同源性

圖2 基于TMUV NS5基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

本試驗(yàn)自表現(xiàn)神經(jīng)癥狀、軟腳的病死鵝臟器中分離到病毒GD06株，經(jīng)對(duì)分離的病毒株進(jìn)行RTPCR鑒定及序列分析表明，初步確定GD06株病毒為TMUV。ELD50的測(cè)定結(jié)果顯示，GD06株的毒力較低，進(jìn)行血清中和試驗(yàn)時(shí)0.2mL的病毒液無(wú)法達(dá)到200ELD50的毒價(jià)，所以僅能進(jìn)行簡(jiǎn)單的定性中和試驗(yàn)，其結(jié)果說(shuō)明GD06株病毒與鴨TMUV抗原相關(guān)性強(qiáng)，動(dòng)物回歸試驗(yàn)也證明GD06株毒力弱。

序列分析表明，分離株GD 0 6與鵝源TMUV JS804株、鴨源TMUV（BYD－1株SD株）有極高的核苷酸（99.8%）及氨基酸（100%）同源性，但這三者之間宿主嗜性、致病性差異等關(guān)系如何需更加深入的研究。

［1］曹貞貞，張存，黃瑜，等.鴨出血性卵巢炎的初步研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（12）：3－6.

［2］Su J，Li S，Hu X，etal.Duck egg－drop syndrome caused by BYD virus，a new Tembusu－related Flavivirus［J］.PLoS One，2011，6（3）：e18106.

［3］Cao Z，Zhang C，Liu Y，etal.Tembusu virus in ducks，China［J］.Emerg Infect Dis，2011，17（10）：1873－1875.

［4］Yan P，Zhao Y，Zhang X，etal.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in ma－inland China［J］.Virology，2011，417（1）：1－8.

［5］萬(wàn)春和，施少華，程龍飛，等.一種引起種（蛋）鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，25（6）：663－666.

［6］滕巧泱，顏丕熙，張旭，等.一種新的黃病毒導(dǎo)致蛋鴨產(chǎn)蛋下降及死亡［J］.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，6：1－4.

［7］傅光華，黃 瑜，施少華，等.雞黃病毒的分離與初步鑒定［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2011，33（3）：1.

［8］陳仕龍，陳少鶯，王劭，等.一種引起蛋雞產(chǎn)蛋下降的新型黃病毒的分離與初步鑒定［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26（2）：170－174.

［9］黃欣梅，李銀，趙冬敏，等.新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（2）：354－360.

［10］萬(wàn)春和，施少華，程龍飛，等.鴨出血性卵巢炎病毒RT－PCR檢測(cè)方法的建立［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26（1）：10－12.