周筱丹，董曉芳，佟建明，徐 鵬

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀100193）

肝臟是家禽脂類代謝的主要器官，因此蛋雞肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)對(duì)脂類代謝的研究具有重要意義。目前肉雞［1］的肝細(xì)胞培養(yǎng)方法已較為成熟。由于蛋雞的解剖結(jié)構(gòu)與肉雞有明顯的差異，采用離體灌流法制備的肝細(xì)胞活率低［2］。因此離體灌流法還無(wú)法代替體內(nèi)灌流法。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)現(xiàn)有成年雞肝臟體內(nèi)灌流方法［1］進(jìn)行優(yōu)化，為獲得更多高質(zhì)量的肝臟細(xì)胞，提供更為合理的細(xì)胞分離和制備方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 用于原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的蛋雞，購(gòu)自北京延慶康莊雞場(chǎng)。選擇健康的25周齡海藍(lán)褐產(chǎn)蛋雞12只，分為2個(gè)處理，分別采用兩種肝細(xì)胞分離和制備方法，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.2 主要試劑 Williams′medium E細(xì)胞培養(yǎng)液、人胰島素、地塞米松、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、青霉素、鏈霉素和抗壞血酸，均購(gòu)自Sigma公司；新生牛血清為Invitrogen公司生產(chǎn)；臺(tái)盼藍(lán)、肝素鈉、戊巴比妥鈉等為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning公司生產(chǎn)。

1.3 蛋雞肝細(xì)胞的制備 于灌流前蛋雞禁食8h，翅靜脈注射4～5mL肝素鈉（1 400UI／mL）抗凝，腹腔注射5～10mL戊巴比妥鈉（50mg／mL體重）麻醉。待雞完全麻醉后，用38℃新潔爾滅溶液全身浸泡消毒，將消毒好的雞放入超凈臺(tái)，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，從腹部中間起始，撥開(kāi)腹部和胸部皮膚；沿胸骨兩側(cè)第一根肋骨剪斷，打開(kāi)胸腔和腹腔，輕輕將腸道拉向軀體左側(cè)，結(jié)扎輸卵管靜脈和胰十二指腸靜脈后，在腸系膜后靜脈下穿2條棉線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端棉線，近心端棉線暫不結(jié)扎；在2條棉線之間用眼科剪將腸系膜后靜脈剪開(kāi)小口，沿肝門靜脈方向插入小鼠灌胃針，并用近心端棉線結(jié)扎固定好小鼠灌胃針。以30mL／min的速度灌注37℃預(yù)熱的無(wú)菌灌流液 A （HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L，EDTA二鈉鹽：5mmol／L；pH 值為7.4），待肝臟臌脹變?yōu)橥咙S色時(shí)剪開(kāi)上腔靜脈，持續(xù)9min，隨后以30mL／min灌注37℃預(yù)熱的無(wú)菌灌流液B（HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3 mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L；pH 值為7.4），持續(xù)10min；待流出的液體變清后，進(jìn)行消化灌流，即以20mL／min灌注40℃預(yù)熱的無(wú)菌灌流液C（HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3 mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L，Ⅱ型膠原酶：0.4g／L和 CaCl2：5.4mmol／L；pH 值為7.4），15min后肝臟塌陷，消化完畢［1］。

1.4 原有的成年雞肝細(xì)胞培養(yǎng)灌流法［1］灌流前將蛋雞血管僅結(jié)扎腸系膜后靜脈遠(yuǎn)心端，輸卵管靜脈和胰十二指腸靜脈不結(jié)扎。

1.5 肝細(xì)胞的分離 以肝臟先臌脹變土黃色隨后變塌陷松軟為肝臟灌流是否成功的標(biāo)志。觸動(dòng)肝臟表面松軟后，摘取消化好的肝臟，放入無(wú)菌平皿中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Williams′medium E細(xì)胞培養(yǎng)液含10%新生牛血清），剔除血管、脂肪和結(jié)締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分；用鑷子撕開(kāi)肝臟包膜，肝細(xì)胞大量流出，用大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過(guò)100目、200目及400目細(xì)胞篩，所得肝細(xì)胞懸液用基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗，并500r／min離心5 min，棄上清后，沉淀用基礎(chǔ)培養(yǎng)液再清洗1次，離心（500r／min，5min）棄上清。用貼壁培養(yǎng)液重懸（Williams′medium E細(xì)胞培養(yǎng)液含10%新生牛血清、1μmol／L 人胰島素、1μmol／L 地塞米松、10 μg／mL人轉(zhuǎn)鐵蛋白、10μg／mL抗壞血酸和1%青霉素、鏈霉素）。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率檢測(cè) 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力，吸取100μL細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)1∶1等體積混合均勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算出制備出的肝細(xì)胞數(shù)量和活率。計(jì)算公式：

細(xì)胞活率（%）＝ 未染色的細(xì)胞數(shù)目／（未染色的細(xì)胞數(shù)目＋染色的細(xì)胞數(shù)目）×100%［19］。

1.7 蛋雞肝細(xì)胞的原代培養(yǎng) 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用貼壁培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋為5×105個(gè)／mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種2mL細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，細(xì)胞貼壁后換用無(wú)新生牛血清的 Williams′medium E。繼續(xù)培養(yǎng)，以后每24h更換一次培養(yǎng)液。

1.8 蛋雞肝細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的測(cè)定 細(xì)胞換液前，分別于4、24、48、144、168h收集6孔細(xì)胞培養(yǎng)液，以4℃12 000r／min，離心10min，取上清保存在－20℃冰箱，待測(cè)LDH活力。具體操作方法按照南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)的LDH測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將0.05 mL待測(cè)樣本與基質(zhì)緩沖液1∶5混合，加0.05mL NADH 混勻，37℃水浴15min，加0.25mL 2，4－二硝基苯肼37℃水浴15min，加0.4mol／L NaOH溶液2.5mL，室溫放置3min，440nm蒸餾水調(diào)零1cm光徑測(cè)吸光度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS（8.02）軟件的 ANOVA程序進(jìn)行方差分析，用Duncan′s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果

2.1 不同方法下肝臟灌流成功率、肝細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率比較 采用本方法分離蛋雞肝臟細(xì)胞，6次試驗(yàn)均灌流成功，肝臟灌流成功率達(dá)到100%，采用原有的成年雞肝細(xì)胞培養(yǎng)灌流法，6次試驗(yàn)僅灌流成功2次，肝臟灌流成功率僅為33.3%。由表1可知，本方法培養(yǎng)的肝細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出從每個(gè)肝臟獲得的肝細(xì)胞數(shù)量為（1.09±0.21）×109個(gè)，肝細(xì)胞數(shù)量是采用原有方法的122倍。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活率，本方法所獲得的肝細(xì)胞活率比采用原有方法提高了17.4%。

表1 不同方法下肝細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率比較

2.2 不同方法下肝細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活力的測(cè)定 不同肝細(xì)胞培養(yǎng)灌流法分離的肝細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH的測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。由表2可知，本方法和原有方法制備的肝細(xì)胞，其培養(yǎng)基上清液中LDH活力在4、24、48、144h和168h無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 培養(yǎng)基上清液中的LDH的活力的測(cè)定 （U／L）

3 討論

3.1 不同方法下肝臟灌流成功率、肝細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率比較 原有的成年雞肝細(xì)胞制備方法多以肉雞和種公雞作為試驗(yàn)動(dòng)物［3］，采用結(jié)扎腸系膜后靜脈的兩步原位灌流法制備肝細(xì)胞，取得了良好的效果。但這一分離方法在蛋禽肝細(xì)胞的制備上并不適用，肝臟灌流成功率太低是其不適用的主要原因。與肉雞和種公雞不同，蛋禽具有發(fā)達(dá)的輸卵管靜脈叢，輸卵管靜脈與肝門靜脈相通，因此按原有的成年雞肝細(xì)胞培養(yǎng)灌流法會(huì)極易導(dǎo)致灌流液無(wú)法完全進(jìn)入肝臟，肝臟不能與灌流液充分接觸導(dǎo)致灌流失敗。肝臟灌流是肝細(xì)胞分離技術(shù)最重要的環(huán)節(jié)，灌流的成功與否直接影響肝細(xì)胞制備的數(shù)量和存活率。通過(guò)兩種方法的對(duì)比試驗(yàn)，可知本方法可以保證較高的成功率，肝細(xì)胞數(shù)量和活率也保證試驗(yàn)的需求。

3.2 不同方法下肝細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活力的測(cè)定 LDH存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜破損時(shí)大量的LDH從細(xì)胞內(nèi)泄露出來(lái)。細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH的活力，常是用來(lái)指示細(xì)胞的損傷程度，反應(yīng)了細(xì)胞膜的完整性。環(huán)境中LDH的活力越低，表明細(xì)胞膜受損的程度越?。?］。本試驗(yàn)結(jié)果與陳曉春等［2］的報(bào)道相一致。但與Jauregui等［4］報(bào)道小鼠肝臟細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活力為（9.2±1.5）×10－6IU不一致，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物不同有關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)蛋雞肝細(xì)胞分離和制備方法進(jìn)行優(yōu)化，可使肝臟灌流成功率提高至100%，每只雞可獲（1.09±0.21）×109個(gè)肝臟細(xì)胞，肝細(xì)胞活率為（95.3±1.3）%；肝細(xì)胞形態(tài)和培養(yǎng)基上清液中的LDH活力與原方法無(wú)顯著差異。因此，本試驗(yàn)方法與原有方法相比，更適用于產(chǎn)蛋家禽肝細(xì)胞的制備和培養(yǎng)，效果更佳。

［1］陳黎龍，江青艷，朱曉彤，等.成年雞肝細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：385－389.

［2］陳曉春，陳代文，張克英，等.AICAR和二甲雙胍對(duì)產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞AMPK活性及脂質(zhì)代謝的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（8）：769－773.

［3］Andradejr D R，Andrade D R，Santos S A.Study of Rat Hepatocytes in Primary Culture Submitted to Hypoxia and Reoxygenation：Action of the Cytoprotectors Prostaglandin E1，Superoxide Dismutase，Allopurinol and Verapamil［J］.Arquivos de Gastroenterologia，2009，46（4）：333－340.

［4］Jaurequi H O，Hayner N T，Driscoll J L，etal.Trypan Blue Dye Uptake and Lactate Dehydrogenase in Adult Rat Hepatocytes－Freshly Isolated Cells，Cell Suspensions，and Primary Monolayer Cultures［J］.In Vitro，1981，17（12）：1100－1110.