范一霖，羅 麗，曾 玲*，龍秀珍，李敦松

(1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州510630;2．廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣州510640)

桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)可為害楊桃、香蕉、柑桔、番石榴等多種水果、蔬菜及野生植物 (Christenson and Foote，1960;Allwood and Drew，1997)，食性雜、寄主廣泛，對(duì)我國(guó)的果蔬生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅 (梁廣勤等，2008)。桔小實(shí)蠅的寄生性天敵種類較多，近年來(lái)，許多學(xué)者致力于桔小實(shí)蠅寄生性天敵的研究與利用工作，有關(guān)研究報(bào)道了桔小實(shí)蠅的一種寄生蜂－切割潛蠅繭蜂Psyttlia incise(Silvestri)，并研究了該蜂對(duì)桔小實(shí)蠅的功能反應(yīng) (季清娥，2004;梁光紅等，2006);也有學(xué)者研究了昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)對(duì)桔小實(shí)蠅的控制作用 (林進(jìn)添等，2005)。

前裂長(zhǎng)管繭蜂Diachasminorpha longicaudata(Ashmead)屬膜翅目Hymenoptera，姬蜂總科Ichneumonidea，繭蜂科Bracoindae，對(duì)實(shí)蠅類害蟲(chóng)有很好的控制作用，是利用較為成功的一種。國(guó)外對(duì)于前裂長(zhǎng)管繭蜂的研究工作主要集中于室外釋放、田間種群建立并聯(lián)合其它防治手段進(jìn)行害蟲(chóng)綜合控制 (Wong，1991;Renato et al.，1997)。該蜂由卵、幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)四個(gè)階段構(gòu)成，以桔小實(shí)蠅為寄主時(shí)，約經(jīng)過(guò)20 d完成世代發(fā)育 (邵屯，2008)。

寄生蜂的寄生作用可以引起寄主各方面生理狀況的改變，主要體現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和免疫等多個(gè)方面，也會(huì)影響到寄主的生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。但尚未有對(duì)前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生寄主桔小實(shí)蠅后，引起的寄主各生理指標(biāo)變化的報(bào)道。本文以桔小實(shí)蠅－前裂長(zhǎng)管繭蜂為研究對(duì)象，明確兩個(gè)問(wèn)題:一是在桔小實(shí)蠅生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同血細(xì)胞類型濃度的變化和血淋巴中蛋白質(zhì)種類的變化，二是被前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生后，桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血細(xì)胞類型、濃度的變化，血淋巴中蛋白質(zhì)種類和濃度的變化，以及寄生行為對(duì)幼蟲(chóng)發(fā)育歷期、質(zhì)量的影響，為利用前裂長(zhǎng)管繭蜂控制桔小實(shí)蠅提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

前裂長(zhǎng)管繭蜂于2004年8月從泰國(guó)農(nóng)業(yè)部生物防治研究所引進(jìn)，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室繁育起穩(wěn)定的種群。成蜂于養(yǎng)蟲(chóng)籠中飼養(yǎng)，飼以清水以及30%的蜂蜜水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。桔小實(shí)蠅采自廣州市楊桃公園的落果中，飼養(yǎng)條件為溫度25℃(±5)，相對(duì)濕度70%(±5)，使其在室內(nèi)成功化蛹并羽化后置于養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)，以蒸餾水和人工飼料繁殖3代以上。實(shí)驗(yàn)選取同日同批大小基本一致的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)。

1.2 幼蟲(chóng)血淋巴中血細(xì)胞濃度和比例的測(cè)定

將處于2齡末3齡初的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)以近1∶1的比例置于前裂長(zhǎng)管繭蜂養(yǎng)蟲(chóng)籠中，寄生6 h后取出，在體視鏡下觀測(cè)。被寄生的幼蟲(chóng)體表有明顯的棕褐色的產(chǎn)卵孔，化蛹后其蛹?xì)ど系漠a(chǎn)卵孔仍然清晰可見(jiàn) (圖1、圖2)，篩選出被寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)。

挑選未寄生桔小實(shí)蠅2齡、3齡、蛹前期的幼蟲(chóng)為一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，挑選寄生和未寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)為另外一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。75%的酒精清洗體表，再用pH=7.4的PBS沖洗3次，濾紙擦干，取幼蟲(chóng)的血淋巴。分別提取各處理幼蟲(chóng)血淋巴10μL，加入10μL的抗凝緩沖劑和20μL的PBS，混合均勻。將細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下，采用5點(diǎn)取樣法，觀察3次，取平均值。根據(jù)公式計(jì)算:血細(xì)胞濃度=80個(gè)小方格的總數(shù)/80×4×106×稀釋倍數(shù)/mL(郭軍英，2009)。

分別取各處理幼蟲(chóng)的血淋巴各10μL，加入10μL的抗凝劑和10μL的PBS，混勻，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下，采取5點(diǎn)取樣法觀察每種細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算出比例。共10個(gè)處理，取平均值。

1.3 SDS-PAGE測(cè)定幼蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)種類

用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的種類。取桔小實(shí)蠅5日、6日、7日和8日的幼蟲(chóng)為一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另挑選寄生行為發(fā)生4 h、8 h、24 h和48 h后的被寄生和未被寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)為另一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別取桔小實(shí)蠅血淋巴10μL，用Ringer's生理鹽水稀釋成40μL的蛋白質(zhì)樣品，加入10μL 5×蛋白上樣緩沖液，輕輕震蕩使其充分混合。100℃下加熱5～10 min，離心1 min。取10μL Marker，加入合適的樣品孔中，其余樣品操作同上。本實(shí)驗(yàn)采用的Marker分子量為118、90、50、36、27、20 kDa。濃縮膠采用80V電壓，至分離膠時(shí)采用120V電壓?？捡R斯亮藍(lán)染色后脫色直至清晰地條帶顯現(xiàn)出來(lái)，Bio凝膠成像儀進(jìn)行拍照。

1.4 幼蟲(chóng)血淋巴蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定幼蟲(chóng)血淋巴蛋白質(zhì)濃度。在體視鏡下挑選出寄生過(guò)的幼蟲(chóng)，將寄生過(guò)的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)重新置入飼料中飼養(yǎng)，4 h、8 h、20 h、24 h、32 h、48 h后分別提取血淋巴，收集于1.5 mL的離心管中。取同批未寄生的幼蟲(chóng)血淋巴，作為對(duì)照，以10000 r/min的速度離心，取上清液，置于－40℃下保存。取6支具塞試管，按表1所示加入不同量的溶液，放置10 min后，于595 nm處測(cè)其吸光值，重復(fù)3次，取其平均值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取若干具塞試管，在試管分別中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G－250，再加入1 mL稀釋1000倍的寄生和未寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴，以空白試劑為對(duì)照。在室溫下反應(yīng)5～10 min。使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在595 nm的條件下測(cè)出吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出蛋白濃度。

表1 Braford檢測(cè)法標(biāo)準(zhǔn)曲線配制Table 1 The formulation of standard graph using Braford

1.5 寄生行為對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)發(fā)育歷期、體重的影響

選用桔小實(shí)蠅4日齡的幼蟲(chóng)，以1∶1的比例放入裝有羽化2 d～3 d的前裂長(zhǎng)管繭蜂籠中，寄生6 h后取出。分別挑選出30頭寄生及未寄生的幼蟲(chóng)，單頭飼養(yǎng)。觀測(cè)其外觀、發(fā)育歷期以及體重的變化。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Excel進(jìn)行繪圖。電泳圖用Quantity軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴中血細(xì)胞的濃度、比例差異和蛋白種類差異

桔小實(shí)蠅的幼蟲(chóng)血淋巴中存在3種不同類型的血細(xì)胞:第1類細(xì)胞的細(xì)胞膜平滑，顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核清晰，稱之為A類細(xì)胞。第2類細(xì)胞的細(xì)胞膜表面不平滑，有伸出的偽足，稱之為B類細(xì)胞。第3類細(xì)胞的細(xì)胞膜表面平滑，但內(nèi)部物質(zhì)凝為一團(tuán)，稱之為C類細(xì)胞 (C類細(xì)胞在幼蟲(chóng)血淋巴中的數(shù)量非常少，故在本實(shí)驗(yàn)中忽略不計(jì))。

對(duì)不同齡期桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血細(xì)胞的研究，結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血細(xì)胞濃度約為15～40×106個(gè)/mL，隨著蟲(chóng)齡的增加，血細(xì)胞的濃度呈上升趨勢(shì)，從2齡的16.53×106個(gè)/mL、3齡的30.14×106個(gè)/mL，升至蛹前期的 35.94×106個(gè)/mL。在3個(gè)發(fā)育階段中，A類 (無(wú)偽足)細(xì)胞的濃度均顯著低于B類 (有偽足)細(xì)胞。A類細(xì)胞濃度呈現(xiàn)先下降后再上升的趨勢(shì)，但各個(gè)齡期的差異不顯著，分別為3.13×106個(gè)/mL、2.87×106個(gè)/mL、4.87×106個(gè)/mL;B類細(xì)胞濃度則呈現(xiàn)一直上升趨勢(shì)，從2齡幼蟲(chóng)的13.4×106個(gè)/mL顯著升高至 3齡時(shí)期的 27.27×106個(gè)/mL，再升至蛹前期的31.07×106個(gè)/mL，后者差異不顯著 (圖3)。

在2齡、3齡以及蛹前期的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴中，A類 (無(wú)偽足)細(xì)胞所占的比例比B類(有偽足)細(xì)胞的低。3個(gè)時(shí)期的A類細(xì)胞所占的比例分別為22.59%、11.75%、14.41%，即先顯著下降后略微上升;B類細(xì)胞所占的比例在3個(gè)時(shí)期分別為77.41%、88.25%、85.59%，呈現(xiàn)先顯著上升后略微下降的趨勢(shì) (圖4)。

經(jīng)SDS－PAGE，發(fā)現(xiàn)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴的蛋白條帶為12條，在16 kDa～156 kDa的范圍內(nèi)，但是主要的蛋白條帶集中在35 kDa～56 kDa的范圍內(nèi)。7日齡和8日齡幼蟲(chóng)血淋巴的拖尾現(xiàn)象相對(duì)比較嚴(yán)重，且分子量為43 kDa的蛋白條帶較其他幾日齡明顯，沒(méi)有明顯的特異蛋白出現(xiàn) (圖5)。

圖5 不同日齡桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴蛋白電泳圖Fig.5 SDS－PAGE analysis of the protein in the hemolymph among different instars

2.2 寄生行為對(duì)幼蟲(chóng)血淋巴中血細(xì)胞濃度、比例的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生后，桔小實(shí)蠅血淋巴中A類和B類血細(xì)胞濃度均有所下降，但均無(wú)顯著差異。A類細(xì)胞濃度由3.13×106個(gè)/mL下降至2.93×106個(gè)/mL，B類細(xì)胞由28.47×106個(gè)/mL下降至18.27×106個(gè)/mL(圖6)。寄生行為發(fā)生后，桔小實(shí)蠅血淋巴中的A類血細(xì)胞在所有血細(xì)胞中所占比例上升，由19.68%上升至28.37%。相應(yīng)的B類血細(xì)胞的所占的比例則下降，由80.32%下降至71.63%，均無(wú)顯著差異 (圖7)。

對(duì)細(xì)胞形態(tài)和大小的觀測(cè)表明，寄生和未寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴中不同類型血細(xì)胞基本相同，沒(méi)有顯著的變化。

2.3 寄生行為對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴蛋白種類的影響

SDS－PAGE分析結(jié)果表明桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)的血淋巴蛋白條帶有12條，分子量范圍為16 kDa～156 kDa，有6條帶集中在33 kDa～56 kDa的范圍內(nèi)。寄生和未寄生的蛋白條帶差異并不明顯，在第3條泳帶上出現(xiàn)一條分子量為44.7 kDa的蛋白。這條蛋白在寄生后8 h和未寄生的幼蟲(chóng)血淋巴中均有發(fā)現(xiàn)，但是在24 h開(kāi)始逐步減淡，48 h已經(jīng)完全消失 (圖8)。

圖8 被前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生的和正常桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴SDS－PAGE圖譜的變化Fig.8 SDS－PAGE analysis of the protein in the hemolymph between normal and parasitized B.dorsalis

2.4 前裂長(zhǎng)管繭蜂的寄生行為對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴蛋白濃度的影響

以1.4測(cè)出的吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖9)。得到線性回歸方程式 Y=0.0005X+0.0103，相關(guān)系數(shù) r2=0.9902，表明蛋白質(zhì)在200μg/mL～1000μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合郎伯－比爾 (Lamber－Beer)定律。

圖9 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 The stardard graph

對(duì)寄生桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴中蛋白質(zhì)的研究結(jié)果表明，寄生行為發(fā)生4 h后的桔小實(shí)蠅血淋巴蛋白質(zhì)濃度比未寄生的明顯降低，且差異顯著，此后兩者的血淋巴濃度變化趨勢(shì)相似;22 h后，血淋巴蛋白濃度開(kāi)始上升，至化蛹前期，蛋白濃度再次下降 (圖10)。

圖10 被前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生的和正常桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血淋巴蛋白濃度隨時(shí)間的變化Fig.10 The protein concentration of normal and parasitized B.dorsalis

2.5 寄生行為對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)化蛹率、發(fā)育歷期和體重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被寄生過(guò)的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體表比未寄生的更有通透感和膨脹感，表面更加光滑。寄生行為發(fā)生后，桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期延長(zhǎng)，從8 d延長(zhǎng)至9～11 d(圖11)。

圖11 被前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生的和未寄生桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)隨發(fā)育時(shí)間的累積化蛹率Fig.11 The difference of pupation rate between the normal and parasitized B.dorsalis

寄生行為發(fā)生后，4、5、6日齡的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體重差異不明顯，均呈逐步上升趨勢(shì);自第7 d起，未寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體重開(kāi)始下降，而被寄生的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體重則繼續(xù)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)直至化蛹 (圖12)。

圖12 被前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生和未寄生桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)隨發(fā)育天數(shù)的質(zhì)量變化Fig.12 The difference of weight changes between the normal and parasitized B.dorsalis

3 結(jié)論與討論

血細(xì)胞與昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)有十分緊密的關(guān)系，其數(shù)量的多少在一定程度上反映了昆蟲(chóng)的免疫能力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，2齡時(shí)期的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)血細(xì)胞濃度最低。而據(jù)已有的研究表明，前裂長(zhǎng)管繭蜂偏好寄生2齡末3齡初的幼蟲(chóng) (邵屯等，2008)，據(jù)此推測(cè)前裂長(zhǎng)管繭蜂可挑選寄主在生理上已經(jīng)發(fā)育成熟，同時(shí)血細(xì)胞濃度相對(duì)較低的時(shí)期進(jìn)行寄生，以此來(lái)盡量避免寄主血細(xì)胞的包囊。

血細(xì)胞是寄主識(shí)別和包囊外源物最重要的因子之一，寄生作用會(huì)影響到血細(xì)胞的數(shù)量和組成。菜粉蝶絨繭蜂Cotesia glomeratus寄生寄主后，引起寄主血細(xì)胞總數(shù)的升高 (Strand and Pech，1995)，而索諾齒唇姬蜂Campoletis sonorensis寄生寄主后，卻引起寄主血細(xì)胞數(shù)量的降低 (Davies，1987)。前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生后的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)的血細(xì)胞在形態(tài)和行為上雖沒(méi)有明顯變化，但在濃度和各類型細(xì)胞所占比例上均有變化，尤其是B類細(xì)胞。這些結(jié)果表明寄生行為導(dǎo)致具有偽足的B類細(xì)胞濃度大量下降，在一定程度上抑制了寄主血細(xì)胞的延展能力。

寄生作用能夠影響寄主蛋白質(zhì)的代謝過(guò)程，調(diào)節(jié)蛋白濃度的高低，從而使其朝著有利于寄生蜂發(fā)育的方向變化，甚至?xí)鸺闹餮馨偷鞍追N類的變化。寄生行為發(fā)生初期，寄主體內(nèi)血淋巴蛋白濃度的下降，此時(shí)蜂卵剛剛發(fā)育，無(wú)法正常取食，因此直接從寄主的血淋巴中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)滿足自身的生長(zhǎng)。在寄生22 h后，血淋巴的蛋白濃度開(kāi)始高于未寄生的幼蟲(chóng)蛋白濃度，寄生蜂自主調(diào)節(jié)寄主的營(yíng)養(yǎng)流向，為寄生蜂后期的發(fā)育累積更多的蛋白，以提供能量。已有的研究表明，前裂長(zhǎng)管繭蜂卵在產(chǎn)出24 h之后，漸漸膨大，近48 h基本完成胚胎的發(fā)育。產(chǎn)出32～48 h這段時(shí)間，是桔小實(shí)蠅由卵孵化為幼蟲(chóng)的關(guān)鍵時(shí)期(邵屯，2008)。這與我們的研究成果是一致的，在32～48 h期間，血淋巴蛋白質(zhì)的濃度快速下降，這說(shuō)明寄生蜂的生長(zhǎng)消耗了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在寄生后8 h時(shí)血淋巴中出現(xiàn)了一條分子量為44.72 kDa的蛋白條帶，這個(gè)條帶在圖5中沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)，因?yàn)榍罢咧腥⊙馨偷南喔糁芷跒? d，比此實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)，且這條帶含量微小，在短時(shí)間內(nèi)消失，因此沒(méi)有在試驗(yàn)2.1中檢測(cè)出來(lái)。雖然曾出現(xiàn)新的蛋白，但是這在寄生和未寄生的蟲(chóng)體中都有存在，據(jù)此推測(cè)這條帶和桔小實(shí)蠅自身的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，而與寄生和不寄生無(wú)關(guān)。

寄生作用可以影響寄主的生長(zhǎng)發(fā)育、歷期變化以及營(yíng)養(yǎng)代謝的變化 (Beckage and Gelman，2004)。前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生過(guò)的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)，幼蟲(chóng)的質(zhì)量也呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榧纳饔么龠M(jìn)了寄主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和寄生蜂對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使其在寄主體內(nèi)快速成長(zhǎng)。

前裂長(zhǎng)管繭蜂寄生桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)后，引起了寄主各方面的變化，但是這些變化究竟是何種原因引起的，寄主的不同類型的血細(xì)胞在免疫反應(yīng)中各發(fā)揮何種作用，都有待于進(jìn)一步的研究。

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