張 鵬 紀(jì) 亮 沈 雷 李靜平 王 巖 張翠香 沙 峰

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

基質(zhì)金屬蛋白酶1及其抑制劑在舌癌浸潤性轉(zhuǎn)移中的作用

張 鵬 紀(jì) 亮 沈 雷 李靜平 王 巖 張翠香 沙 峰

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

目的 檢測舌癌黏膜固有層組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的表達(dá)，揭示它們?cè)谏喟┙櫤娃D(zhuǎn)移中的作用。方法應(yīng)用ABC免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測舌癌標(biāo)本及正常組織各取材部位中MMP-1、TIMP-1的免疫學(xué)定位及表達(dá)情況。結(jié)果 舌癌組織的MMP-1和TIMP-1的陽性表達(dá)率與對(duì)照組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；舌癌組織中的MMP-1和TIMP-1的表達(dá)與舌癌大小無關(guān)（P＞0.05），而與舌癌分化程度、有無轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)等具有差異（P＜0.05或P＜0.01）。 結(jié)論 MMP-1和TIMP-1在舌癌黏膜固有層組織中的表達(dá)關(guān)系，有助于判斷舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移及病理分期。

基質(zhì)金屬蛋白酶-1；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1；舌癌

基質(zhì)金屬蛋白-1（matrix metalloproteinases，MMP-1）屬于膠原酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的膠原纖維成分?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases，TIMP-1）對(duì) MMP-1活性有抑制作用，二者之間的平衡可維持ECM中膠原纖維合成和分解的穩(wěn)定，并與腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。腫瘤的浸襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，目前，對(duì)于舌癌如何突破ECM造成浸潤轉(zhuǎn)移尚無定論。本實(shí)驗(yàn)對(duì)舌癌的MMP-1、TIMP-1的表達(dá)及關(guān)系進(jìn)行研究，以解決舌癌浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)組選擇本課題組2006～2008年使用二甲基苯并蒽（DMBA）涂抹金黃地鼠舌體建立的舌癌模型存檔標(biāo)本，其中涂抹 4、8、12、16、20、24 周各為一組，每組 5例，共計(jì) 30例；將上述標(biāo)本切片行HE染色，在顯微鏡下觀察。確定原位癌11例，進(jìn)展期舌癌19例（包括浸潤癌13例，轉(zhuǎn)移癌6例）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者13例。每例均按癌巢大小取取癌中組織（腫瘤中心區(qū)）、癌周組織（腫瘤邊緣區(qū)）；對(duì)照組取上述組織塊中的正常組織各1塊，共計(jì)30例。

1.2 試劑

兔抗人MMP-1、TIMP-1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

HE染色法，光鏡下觀察切片，確定組織的病理分級(jí)：原位癌、浸潤癌、轉(zhuǎn)移癌。應(yīng)用ABC免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測舌癌標(biāo)本各取材部位中MMP-1、TIMP-1的定位及表達(dá)情況。

1.4 結(jié)果判斷

MMP-1、TIMP-1均采用半定量積分法：以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒狀物質(zhì)為陽性，根據(jù)腫瘤細(xì)胞胞漿染色的程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：基本不著色者為0分；著色淡黃色為1分；棕色為2分；深棕色為3分。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率：≤5%為 0分；6%～25%為 1分；26%～50%為 2分；≥51%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分相乘，為 MMP-1、TIMP-1 表達(dá)強(qiáng)度積分。≤1 分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5 分為中等陽性（++）；≥6 分以上為強(qiáng)陽性（+++）。免疫組化ABC法進(jìn)行結(jié)果判斷，用已知陽性切片作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作空白對(duì)照，以正常血清代替一抗作陰性對(duì)照。

1.5 圖像分析

采用image-pro plus全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，觀察、檢測以上2種染色切片，在200倍放大下隨機(jī)選取5個(gè)測定域，分別測定MMP-1和TIMMP-1表達(dá)的數(shù)密度（目標(biāo)數(shù)/統(tǒng)計(jì)場面積）[2]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-1和TIMP-1蛋白在舌癌黏膜固有層中的表達(dá)

MMP-1在舌癌黏膜固有層的陽性表達(dá)率為90.0%（27/30），其中（+++）表達(dá)為 43.3%（13/30），（++）表達(dá)為 26.67%（8/30），（+）表達(dá)為20.0%（6/30），其陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿內(nèi)。TIMP-1在舌癌黏膜固有層的陽性表達(dá)率為86.7%（26/30），其中（+++）表達(dá)為 33.3%（10/30），（++）表達(dá)為 26.7%（8/30），（+）表達(dá)為26.67%（8/30），其陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿內(nèi)。MMP-1和TIMMP-1蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)與對(duì)照組（陽性率分別為10.0%和13.33%）相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在癌中、癌周組織中MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）），見表1。

表1 舌癌黏膜固有層各部位中MMP-1、TIMP-1的強(qiáng)度積分表達(dá)（±s，分）（n=30）

表1 舌癌黏膜固有層各部位中MMP-1、TIMP-1的強(qiáng)度積分表達(dá)（±s，分）（n=30）

指標(biāo) MMP-1癌中組織 癌周組織TIMP-1癌中組織 癌周組織-++++++0.45±0.15 2.21±0.86 4.46±0.58 24.83±0.59 0.49±0.57 2.72±1.86 5.94±1.59 32.59±1.50 0.73±1.34 3.54±0.68 5.97±3.43 21.48±1.35 0.57±1.45 2.52±1.83 5.85±2.47 18.47±1.15

2.2 MMP-1和TIMMP-1蛋白表達(dá)的關(guān)系

隨著周齡的增加，舌癌標(biāo)本組織中的MMP-1和TIMP-1的表達(dá)均增強(qiáng)，二者與舌癌大小無關(guān)（P＞0.05），而與舌癌分化程度、有無轉(zhuǎn)移等差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05或P<0.01），見表2。

3 討論

在生理情況下，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在維持正常組織結(jié)構(gòu)與功能及細(xì)胞生長、分化過程中起到非常重要的作用。大量研究表明，它不再被認(rèn)為是靜止不動(dòng)的，而是處在不斷代謝更新、降解重塑的動(dòng)態(tài)平衡中。近來在研究有關(guān)ECM合成和降解的代謝平衡調(diào)節(jié)中，引人注目的是MMPs和TIMPs兩個(gè)酶系統(tǒng)的作用。ECM的主要成分由膠原纖維和彈性纖維構(gòu)成，MMP-1在這一過程中起著分解膠原纖維的作用。TIMP-1除了是MMP-1的天然抑制劑外，還對(duì)所有類型MMPs均有抑制作用。在生理情況下，它可參與細(xì)胞外基質(zhì)的改建及影響細(xì)胞生長[3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的MMP-1、TIMMP-1含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），亦證明了二者同時(shí)存在于細(xì)胞的生理情況下，可參與細(xì)胞外基質(zhì)的改建及影響細(xì)胞生長。

表2 舌癌黏膜固有層病理特征與MMP-1、TIMMP-1蛋白表達(dá)的關(guān)系

MMPs和TIMPs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)：大部分腫瘤中均可檢測到MMPs和TIMPs的表達(dá)異常。有研究表明，在頭頸部鱗癌中，腫瘤細(xì)胞可通過分泌MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移并影響患者的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后[4]。本研究從表1中可發(fā)現(xiàn)MMP-1隨著舌癌的進(jìn)展，其癌中心區(qū)域高表達(dá)性愈來愈高（P<0.01），說明舌癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)越來越高；當(dāng) MMP-1 表達(dá)為（++）～（+++）時(shí)，癌周圍區(qū)組織的MMP-1表達(dá)比癌中心區(qū)表達(dá)要高，這是由于隨著舌癌的進(jìn)展，癌體積逐漸變大，癌中心區(qū)域會(huì)產(chǎn)生缺血性改變，中心區(qū)細(xì)胞缺血，減少分泌MMP-1的同時(shí)，還會(huì)分泌缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)新生血管形成[5]，而新生血管的發(fā)生必須侵及基底層到達(dá)癌體，此時(shí)癌周圍區(qū)域受到缺血、細(xì)胞因子等因素刺激會(huì)使MMP-1分泌就會(huì)迅速升高，以溶解膠原纖維，促使新生血管的形成[6]。MMP-1增多的同時(shí)，TIMP-1也會(huì)相應(yīng)增多，這是機(jī)體的應(yīng)答機(jī)制，原位雜交也發(fā)現(xiàn)MMP的mRNA主要分布在腫瘤邊緣的間質(zhì)細(xì)胞中，或同時(shí)分布在瘤細(xì)胞和間質(zhì)中[7]，造成這種不同分布的機(jī)制可能就是由于腫瘤血管生成的需要，也說明MMP-1具有促血管生成的作用。但是從表1來看，雖然MMP-1和TIMP-1皆升高，但是后者的升高的程度較小。這主要是由于MMP家族有激活的級(jí)聯(lián)效應(yīng)[8]，導(dǎo)致20周以后MMP-1表達(dá)明顯升高。通過表2可以發(fā)現(xiàn)MMP-1和TIMP-1的表達(dá)與腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），但與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等具有密切聯(lián)系 （P<0.01），這是由于MMP-1參與破壞基底層的膠原纖維，以利于舌癌的轉(zhuǎn)移，這與低分化細(xì)胞分泌高表達(dá)的MMP-1觀點(diǎn)相一致[9]。Gunduz等[10]通過研究口腔纖維化，發(fā)現(xiàn)TIMP-1在纖維化的病損比正常高，可能MMP-1會(huì)使細(xì)胞外基質(zhì)的合成和堆積增加，高表達(dá)的TIMP-1對(duì)MMP-1的抑制作用，從而破壞MMPs與TIMP的動(dòng)態(tài)平衡，TIMP-1在口腔黏膜下纖維化的成纖維細(xì)胞中表達(dá)，隨著口腔黏膜纖維化的嚴(yán)重程度加大而增加，因此TIMP-1可能與口腔黏膜纖維化的病理過程有關(guān)[11]。MMP-1和TIMP-1在舌癌的發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用不僅是通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的，而且還可以促進(jìn)腫瘤組織中新生血管的形成，增強(qiáng)了腫瘤侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力，抑制MMP-1具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的雙重作用。

綜上所述，MMP-1和TIMP-1在舌癌黏膜固有層組織中的表達(dá)與舌癌進(jìn)展密切相關(guān)，與舌癌分化程度、有無轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)等關(guān)系密切，可作為判斷舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移及病理分期的參考?？梢灶A(yù)見，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療中，將具有良好的應(yīng)用前景。

[1]Polette M，Nawrocki-Raby B，Gilles C，et al.Tumour invasion and matrix metalloproteinases[J].Crit Rev Oncol Hematol，2004，49（3）：179-186.

[2]吳旋，蘇振忠，蔣愛云，等.瘢痕性喉狹窄瘢痕組織中彈性纖維和膠原纖維分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2005，26（3）：312-315.

[3]趙海，于志丹.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2005，6（2）：4-6.

[4]Charoenrat P，Modjtahedi H，Rhys P，et al.Epidermal growth factor like ligands differentially up-regulate matrix metalloproteinase-9 in head and neck squamous carcinoma cells[J].Cancer Res，2000，60（4）：11-18.

[5]陳晶，盧娜，郭青龍.腫瘤血管生成機(jī)制及抗血管生成藥物的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2007，7（1）：49-52.

[6]Bjorklund M，Koivunen E.Gelatinase-mediated migration and invasion of cancer cells[J].Biochim Biophys Acta，2005，1755 （1）：37-69.

[7]張志剛.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑與疾病的關(guān)系[J].國外醫(yī)學(xué)：生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，1997，14（7）：351-353.

[8]陳意生.腫瘤分子生物學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：67.

[9]Arai I，Nagano H，Kondo M，et al.Overexp ression of MT3-MMP in hepatocellularcarcinoma correlates with cap sularinvasion [J].Hepatogastroenterology，2007，54 （73）：167-171.

[10]GunduzK，DemireliP，InanirI，etal.Expressionofmatrixmetalloproteinases（MMP-2， MMP-3，and MMP-9） and fibronectin in lichen planus[J].J Cutan Pathol，2006，33（8）：545-550.

[11]Sutinen M，Kainulainen T，Hurskainen T，et al.Expression of matrix metalloproteinases（MMP-1 and-2） and their inhibitors（TIMP-1，-2 and-3） in oral lichen planus，dysplasia，squamous cell carcinoma and lymph node metastasis[J].British Joumal of Cancer，1998，77 （12）：2239-2245.

Effect of MMP-1 and TIMP-1 in tongue cancer with invasion and metastasis

ZHANG Peng JI Liang SHEN LeiLI Jingping WANG Yan ZHANG Cuixiang SHA Feng Department of Anatomy,Qiqihar Medical University,Heilongjiang Province,Qigihar 161006,China

ObjectiveTo detect the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1),tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1(TIMP-1)in mucosa lamina propria tissue of tongue cancer,in order to reveal the role of MMP-1 and TIMP-1 in the invasion and metastasis of tongue cancer.MethodsThe immunological localization and expression of MMP-1 and TIMP-1 in tongue cancer specimens and normal tissues were detected by immunohistochemical staining methods(ABC method).ResultsPositive expression rate of MMP-1 and TIMP-1 between tongue cancer tissues and normal tissues was significantly different(P＜0.01).The expression of TIMP-1 and MMP-1 in tongue cancer tissues had no relationship with the size of tongue cancer(P＞0.05),but it had significantly differences compared with differentiation degree,metastasis and pathological grade of tongue cancer(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionThe expression of MMP-1 and TIMP-1 in mucosa lamina propria tissue of tongue cancer can contribute to judge the invasion,metastasis and pathological grade of tongue cancer.

Matrix metalloproteinase-1;Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1;Tongue cancer

R735.3

A

1673-7210（2012）08（c）-0014-03

黑龍江省齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：細(xì)胞外基質(zhì)在鼠舌癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的實(shí)驗(yàn)性研究）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目 （No：12521635）； 黑龍江省 自 然 科 學(xué) 基 金課 題項(xiàng) 目 （No：D200957）；黑龍江省齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：Tenascin-C、MMP-1及其抑制因子對(duì)人增生性瘢痕作用的分子機(jī)制；No：SHFZD9011）。

2011-12-18 本文編輯：谷俊英）