李 強(qiáng), 季更生, 朱 婧, 谷緒頂, 費(fèi)娟娟, 馮圓圓

(1.江蘇科技大學(xué) 生物與化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018) (2.清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100084)

紫杉醇(Taxol,商品名Paclitaxel)最早被發(fā)現(xiàn)存在于紅豆杉中,于1971年由美國的Wani等從短葉紅豆杉中提取,并且確定其具有穩(wěn)定微管和抑制微管解聚的作用,擁有良好的抗腫瘤活性[1]．紫杉醇是二萜類生物堿,對(duì)乳腺癌、卵巢癌等10多種癌癥具有顯著療效,同時(shí)該藥還對(duì)糖尿病等多種疑難病有一定治療潛力[2]． 纖維素作為世界上最豐富的天然可再生資源,其開發(fā)與利用對(duì)解決人類面臨的資源危機(jī)具有重要意義[3]．但是目前還未發(fā)現(xiàn)能利用纖維素作為原料生產(chǎn)紫杉醇的微生物．本實(shí)驗(yàn)從紅豆杉中分離出206株內(nèi)生真菌．通過TLC、HPLC檢測(cè)紫杉醇產(chǎn)量,旨在分離能夠利用廉價(jià)的纖維素作為原料生產(chǎn)紫杉醇的菌株以用于高產(chǎn)菌株的選育．

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和試劑

以樹齡在百年以上的南方紅豆杉(Taxus chinensis)為原料,取其樹皮、樹枝、樹根、樹葉,用無菌袋封裝．顯色劑:1%香草醛濃硫酸溶液;展開劑: 氯仿與甲醇混合液(7 ∶1,體積比);紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司(99%)．乙腈、乙醇、氯仿、甲醇等均為色譜純,購自國藥集團(tuán)．

1.1.2 培養(yǎng)基

① 樹木浸汁—水瓊脂培養(yǎng)基[4]:2 g瓊脂,98 mL水,加入2 mL的樹木浸汁;② 查氏液體培養(yǎng)基和查氏瓊脂[5];③ 查氏酵母膏瓊脂[5];④ 纖維素分解培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g,硝酸鈉 20 g,磷酸氫二鉀1 g,氯化鉀 0.5 g,硫酸鎂 0.5 g,硫酸鐵 0.01 g,水1 000 mL，pH 6.5；⑤ 紫杉醇生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基L1：碳源(蔗糖14 g/L或纖維素15 g/L)，氯化錳0.005 g，硫酸鎂0.003 6 g，硫酸鋅0.002 5 g，硝酸銅0.001 g，氯化鐵0.002 g，醋酸鈉0.001 g，硝酸鈣0.006 5 mg，磷酸二氫鉀0.14 g，蛋白胨2.8 g，酵母膏3.5 g，加水至1 000 mL，pH 6.5，⑥ 麥芽汁瓊脂：稱取麥芽汁固體濃縮物40 g，加入1 000 mL蒸餾水中，加入瓊脂粉20 g，加熱溶解滅菌備用．

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀:SPD-10A VP高效液相色譜儀(SHIMADZU);色譜柱:苯基柱(4.6 mm×250 mm)，購自大連依麗特公司．熒光/相差顯微成像系統(tǒng)BX-51(OLYMPUS)．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)生真菌的分離

將樹皮、樹枝、樹根、樹葉用無菌水洗凈,用75%酒精處理1～3 min進(jìn)行消毒,用無菌水清洗三次,接著用鋒利的無菌刀將樹皮、樹枝、樹根、樹葉切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊．接種于樹木浸汁—水瓊脂培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)．待樹木小段表面長出菌絲后,用三區(qū)劃線法純化出單菌落[5]．同時(shí)將消毒過的樹木小段于PDA培養(yǎng)基平板上滾動(dòng)擦拭,此平板與樹木浸汁—水瓊脂培養(yǎng)基平板一起培養(yǎng),作為對(duì)照組檢驗(yàn)樹木小段表面消毒是否徹底．

1.3.2 菌的培養(yǎng)及其發(fā)酵產(chǎn)物的萃取

在查氏培養(yǎng)基上連續(xù)傳10代后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),用L1液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株,28 ℃恒溫,120 r/min振蕩培養(yǎng)．分別抽濾培養(yǎng)了2，4，6，8，10，12，14 d的發(fā)酵物,用等體積的乙酸乙酯分兩次對(duì)濾液進(jìn)行萃取,分液漏斗靜置1 h分層．取上層有機(jī)相,棄下層水相．同時(shí)提取菌體中的紫杉醇,將研磨抽濾后的菌體,加入30 mL的乙酸乙酯,振蕩萃取30 min過濾,將濾液與發(fā)酵液萃取后的有機(jī)相混合．用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑乙酸乙酯,45 ℃干燥．用0.4 mL乙腈洗下紫杉醇,用乙腈定溶至0.5 mL．

1.3.3 紫杉醇產(chǎn)量的測(cè)定

① TLC檢測(cè):取標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇溶液和樣品分別點(diǎn)樣于G硅膠的薄層層析板上[4],置于展開劑預(yù)飽和層析缸中展開,晾干,用香草醛濃硫酸顯色．觀察斑點(diǎn)的大小、位置和顏色,計(jì)算遷移率．② HPLC檢測(cè):將紫杉醇粗提物過100目的硅膠柱,做進(jìn)一步提純分離,收集含有紫杉醇的洗脫液．SPD-10A VP高效液相色譜儀,紫外檢測(cè)儀檢測(cè),檢測(cè)波長228 nm，流動(dòng)相乙腈 ∶水=65 ∶45，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃,柱壓10 Mpa．

1.3.4 菌種的鑒定

① 菌落形態(tài)研究:采用查氏瓊脂、查氏酵母膏瓊脂、麥芽汁瓊脂,在培養(yǎng)基表面點(diǎn)接,25 ℃下,倒置培養(yǎng)5～7 d進(jìn)行觀察．并在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察菌絲體形態(tài)[5]．② 液體培養(yǎng)形態(tài):將BJ-11的孢子接入查氏液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)2～10 d觀察．③ 個(gè)體形態(tài)研究：取PDA 瓊脂平板上25 ℃生長3～7 d的培養(yǎng)物,分別采用水浸片與載玻片培養(yǎng)[5]相結(jié)合的方法,在顯微鏡下進(jìn)行觀察,同時(shí)采用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影和運(yùn)用測(cè)微尺進(jìn)行顯微測(cè)量．根據(jù)真菌鑒定手冊(cè),通過形態(tài)比對(duì),對(duì)菌株進(jìn)行鑒定．

1.3.5 菌株BJ-11發(fā)酵纖維素制備紫杉醇

按照接種量5%接入到100 mL紫杉醇發(fā)酵培養(yǎng)基L1中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵溫度28 ℃,搖床轉(zhuǎn)動(dòng)速率180 r/min,發(fā)酵16 d,從第二天起每2 d取樣用HPLC檢測(cè)紫杉醇產(chǎn)量．同時(shí)每2 d采用文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法檢測(cè)發(fā)酵液中纖維素酶的活性．

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種分離結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研究了先后從東北紅豆杉中分離得到的206株內(nèi)生菌,經(jīng)過TLC檢測(cè)有5株菌能夠產(chǎn)生紫杉醇,選擇其中一株產(chǎn)量最高、最有選育潛力的菌株BJ-11進(jìn)行研究．BJ-11經(jīng)過3 d即可在查氏瓊脂上產(chǎn)生大量的孢子,由此可見,它適合于利用孢子進(jìn)行菌種選育,有利于進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)量．

菌株BJ-11經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,其發(fā)酵液的萃取抽提物經(jīng)TLC顯色,紫杉醇在香草醛濃硫酸顯色劑存在時(shí)顯示藍(lán)色,樣品的遷移率和遷移位置與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣品一致,均為0.67;經(jīng)HPLC分析,結(jié)果與Taxol標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致的峰出現(xiàn)．TLC和HPLC的結(jié)果表明：菌株BJ-11能夠產(chǎn)生紫杉醇．經(jīng)過計(jì)算菌株BJ-11以蔗糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)紫杉醇產(chǎn)量為127.10 μg/L，這個(gè)產(chǎn)量在已報(bào)道的紫杉醇產(chǎn)生菌中屬于高產(chǎn)菌株[4]．

對(duì)培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，14 d的發(fā)酵物產(chǎn)生紫杉醇的量進(jìn)行分析,BJ-11菌株在第2 d就能夠產(chǎn)生紫杉醇20.15 μg/L(見圖1)，10 d與12 d，14 d產(chǎn)生紫杉醇的量差異不顯著．結(jié)果表明：該菌株產(chǎn)生紫杉醇的時(shí)間早,生長快,利用蔗糖作為碳源10 d就可達(dá)到最大產(chǎn)生量,而目前報(bào)道的高產(chǎn)菌株一般在14 d以后才可以達(dá)到最大產(chǎn)量[4]．因此該菌株是一株優(yōu)良的紫杉醇產(chǎn)生菌,相信經(jīng)過進(jìn)一步的選育可以大幅度地提高紫杉醇的產(chǎn)量．

圖1 BJ-11發(fā)酵蔗糖生產(chǎn)紫杉醇

纖維素作為世界上最豐富的天然可再生資源,其開發(fā)與利用對(duì)解決人類面臨的資源危機(jī)具有重要意義．目前利用纖維素直接生產(chǎn)紫杉醇還鮮見報(bào)道．本研究結(jié)果表明(圖2a)：菌株BJ-11可以在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長．本研究繼而以微晶纖維素作為唯一碳源采用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵制備紫杉醇．菌株BJ-11分泌纖維素酶降解纖維素,繼而將纖維素降解的糖轉(zhuǎn)化為紫杉醇,發(fā)酵過程見圖2b)．發(fā)酵的前2 d沒有紫杉醇產(chǎn)生,菌株處于營養(yǎng)生長階段,相應(yīng)的發(fā)酵液中纖維素酶的活性也較低,只有0.1 U/mL．發(fā)酵5～8 d時(shí)纖維素酶酶活性達(dá)到最大0.5 U/mL,相應(yīng)的紫杉醇產(chǎn)量迅速提高,從10 μg/L增長到48 μg/L．10～14 d時(shí)纖維素酶活性逐漸降低,發(fā)酵14 d時(shí)紫杉醇產(chǎn)量達(dá)到最高110 μg/L．發(fā)酵18 d時(shí)纖維素酶活性基本喪失,紫杉醇產(chǎn)量不再增加,菌株的發(fā)酵能力基本喪失．結(jié)果表明：菌株BJ-11可以較好地利用纖維素作為唯一碳源生產(chǎn)紫杉醇,可大大降低發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的成本．

2.2 BJ-11紫杉醇生產(chǎn)穩(wěn)定性

因?yàn)檫@些菌株均經(jīng)無紅豆杉枝葉浸汁的查氏培養(yǎng)基上連續(xù)傳10代(G)后再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),所以其Taxol完全來自于菌體的代謝產(chǎn)物．傳10 G后該菌的紫杉醇產(chǎn)量仍然恒定,而且保持在125.11～127.20 μg/L的較高水平(表1),這說明該菌具有較穩(wěn)定的產(chǎn)生紫杉醇的能力,具有進(jìn)一步選育的潛力[7]．

a) 纖維素培養(yǎng)基上4 d的菌落

b) 利用纖維素生產(chǎn)紫杉醇發(fā)酵過程

表1 菌株BJ-11紫杉醇生產(chǎn)穩(wěn)定性考察

2.3 BJ-11的鑒定

菌株BJ-11在查氏培養(yǎng)基上生長迅速,25 ℃生長7 d直徑可達(dá)40～60 mm,平坦，質(zhì)地絲絨狀,有的菌株有較多的氣生菌絲;在PDA 培養(yǎng)基上菌落致密、全緣、平展、初期菌落白色(圖3),后期呈深黑色,菌落表面有大量的孢子,背面白色,無滲出物．菌落中央黑色,邊緣白色．菌絲直徑2.5～7.5 μm,菌絲有隔．孢子頭炭黑色,無滲出液．分生孢子頭初為球形,老時(shí)分裂成幾個(gè)圓柱狀結(jié)構(gòu)頂囊球形,無色透明;產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層,分生孢子球形,直徑7～9 μm,壁顯著粗糙,生長后期成疣狀．將上述BJ-11菌株的形態(tài)與《真菌鑒定手冊(cè)》和《中國真菌志》中的相關(guān)真菌進(jìn)行比對(duì),可將BJ-11菌株鑒定為子囊菌綱,真子囊菌亞綱,曲霉目,曲霉科,曲霉屬,環(huán)繞亞屬,黑色組,炭黑曲霉[5,7]．

a) 樹木段上長出的菌絲

b) 生長7 d的菌落

c) 頂囊和足細(xì)胞

d) 菌絲

e) 孢子

f) 頂囊

圖3BJ-11的鑒定圖

Fig.3IdentificationimageofstrainBJ-11

3 結(jié)論

從紅豆杉中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌BJ-11,經(jīng)鑒定BJ-11為炭黑曲霉．BJ-11可以產(chǎn)生紫杉醇,以蔗糖為碳源發(fā)酵10 d，紫杉醇產(chǎn)量可達(dá)127.20 μg/L．BJ-11在查氏瓊脂上歷經(jīng)3d即可產(chǎn)生大量孢子,適于利用孢子進(jìn)行菌種選育,有利于進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)量．以纖維素為碳源,采用BJ-11生產(chǎn)紫杉醇,歷經(jīng)10 d即可達(dá)最大產(chǎn)量(生產(chǎn)速度快于目前報(bào)道的14 d),故BJ-11堪稱是一株優(yōu)良的紫杉醇產(chǎn)生菌．

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