鄒美圣 劉 凌 劉 澤 (廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院干部病房五科，廣東 廣州 510010)

炎性衰老中的促炎性反應與老年相關疾病如動脈粥樣硬化(AS)等密切相關〔1〕。在炎癥反應中，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等因素可促進白細胞、單核細胞及淋巴細胞等與內(nèi)皮細胞黏附。在這些炎癥細胞與內(nèi)皮細胞黏附的過程由細胞表面的細胞黏附分子所介導。整合素αvβ3表達于內(nèi)皮細胞，通過調節(jié)白細胞在內(nèi)皮細胞表面的滾動速率，介導白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附參與炎癥反應〔2，3〕。目前，在AS發(fā)病中研究較多的細胞黏附分子主要有細胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細胞間黏附分子(VCAM-1)、E-選擇素(E-sel)和 P-選擇素(P-sel)等，而整合素αvβ3則鮮有報道。本研究旨在探討在AngⅡ誘導HUVECs衰老中整合素αvβ3表達的變化。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株HUVECs由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科提供;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、AngⅡ、CCK-8購自美國Sigma公司;細胞周期流式細胞分析試劑盒、細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑公司;兔抗整合素αvβ3單克隆抗體(CST公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自聚研生物科技公司，BCA蛋白試劑盒(Thermo scientific公司);PVDF膜、ECL發(fā)光液(Millipore，美國);倒置顯微鏡(Olympus公司，日本);酶標儀(Tecan Genios，瑞士);流式細胞儀(Miltenyi公司，德國)，Quantity One凝膠圖像處理軟件(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的培養(yǎng)和鑒定 HUVECs細胞株貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液一次維持細胞良好生長狀態(tài)。待細胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVECs呈多角形，單層鋪路石樣緊密排列。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活率 將細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，每孔加100 μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱過夜，棄去培養(yǎng)液后，對照組(5孔)每孔加入100 μl培養(yǎng)液，實驗組(每組5孔)加入含不同濃度(10－8、10－7、10－6和 10－5mol/L)AngⅡ100 μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前向每孔加入CCK-8 20 μl培養(yǎng)1 h，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm下測定各孔OD值，以藥物組與對照組OD值百分比代表細胞增殖率。每組設5復孔，重復3次。

1.2.3 衰老細胞鑒定 細胞長至亞融合后，無血清同步12 h，加入終濃度為10－6mol/L AngⅡ，持續(xù)刺激48 h，第12、24小時各補充AngⅡ一次即為AngⅡ誘導的HUVECs衰老模型。對照組為不含AngⅡ上述培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.2.3.1 β-半乳糖苷酶染色 根據(jù)細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒操作方法，將原培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液棄去，PBS清洗細胞1次，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 ml，室溫固定15 min。吸除固定液后PBS洗3次，每次3 min。每孔加入染色工作液1 ml，37℃無CO2條件下孵育過夜。用保鮮膜將六孔板封住以防止蒸發(fā)。熒光顯微鏡下每組標本隨機選取5個視野，胞漿藍染者為衰老細胞，計算衰老細胞占觀察細胞總數(shù)的百分比。

1.2.3.2 細胞周期分析 收獲的細胞冷乙醇4℃固定過夜。取5×106細胞，1 000 r/min離心棄乙醇，PBS洗兩遍;加入碘化丙啶(PI)染液，4℃避光孵育30 min。過篩后立刻上機檢測進行細胞流式周期分析。

1.2.4 Western印跡檢測整合素αvβ3水平 收集AngⅡ誘導0、12、24、36、48 h 細胞，用冷 PBS 洗 2 次，加入預冷的含 1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上充分裂解細胞30 min，4℃、離心30 min取上清分裝，加入2倍上樣緩沖液沸水變性5 min，－20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)BCA蛋白濃度定量試劑盒操作說明測定蛋白樣品濃度，每個樣品上樣量為20 μg，蛋白經(jīng)過12%SDSPAGE凝膠電泳，100 V、2 h，分離后，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST室溫下緩慢搖動封閉1 h，加入一抗，在4℃孵育過夜，TBST洗滌后，與二抗室溫孵育1 h，常規(guī)洗膜化學發(fā)光試劑顯色，X線片顯影，計算機圖像處理系統(tǒng)對X線片上顯影的條帶進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以s表示，計量資料比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 細胞存活率 CCK-8法檢測表明，經(jīng)不同濃度AngⅡ培養(yǎng) HUVECs 48 h 后，10－8和 10－7mmol/L AngⅡ組細胞存活率〔(91.67±4.23)%、(86.67±5.06)%〕與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05);10－6mmol/L AngⅡ組和 10－5mmol/L AngⅡ組存活率〔(97.15±1.85)%、(55.61±7.92)%〕比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。10－5mmol/L AngⅡ在48 h即引起細胞生長停滯，增殖率降低，從而可能因濃度過高而導致細胞凋亡或壞死，不能誘發(fā)細胞衰老;10－8mmol/L AngⅡ組和10－7mmol/L AngⅡ在48 h內(nèi)仍未引起明顯的細胞生長停滯，從而可能因濃度過低不至于引起細胞衰老;10－5mmol/L AngⅡ組細胞存活率為(77.15±1.85)%，故本實驗選用10－6mol/L AngⅡ建立HUVECs衰老模型。

2.2 衰老細胞鑒定

2.2.1 SA-β-gal活性 SA-β-gal化學染色陽性細胞的胞漿和胞核呈藍染。染色前用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變。對照組HUVECs生長良好，呈多角形或梭形;AngⅡ誘導組HUVECs體積較大，形態(tài)不一，胞漿中可見較多顆?；蚩张荨Ｈ旧髮φ战M幾乎不表達β-gal，AngⅡ誘導組β-gal陽性細胞數(shù)明顯增加，約80%細胞染色陽性。見圖1。

2.2.2 細胞周期分析 流式細胞術分析結果顯示，對照組HUVECs的各期比例正常，AngⅡ誘導大部分細胞停滯于G0/G1期，S期及G2/M期趨于消失(表1)，與對照組比較各周期的細胞比例差異有統(tǒng)計學意義(F=92.329，P＜0.01)。表明誘導組細胞生長逐漸停滯，細胞增殖能力明顯下降。

圖1 AngⅡ對HUVECs形態(tài)及SA-β-gal活性的影響

表1 AngⅡ對細胞周期的影響(%， s，n=5)

表1 AngⅡ對細胞周期的影響(%， s，n=5)

與對照組比較：1)P＜0.01

組別 G0/G1期 S期 G2/M期49.5±5.5 31.0±5.3 19.4±1.7 AngⅡ誘導組 89.4±3.41) 8.0±3.11) 2.0±1.51)對照組

2.3 整合素αvβ3的表達 Western印跡法顯示，HUVECs靜息時表達少量的整合素αvβ3，AngⅡ呈時間依賴性地上調整合素αvβ3表達，AngⅡ誘導 HUVECs 12 h，整合素 αvβ3表達逐漸增高，48 h整合素 αvβ3表達是 0 h的 1.5倍(F=72.582，P ＜0.01)。見圖2。

圖2 AngⅡ誘導HUVECs整合素β3表達電泳圖

3 討論

目前血管緊張素系統(tǒng)在血管衰老機制研究中逐漸被重視，AngⅡ信號級聯(lián)反應隨衰老增加，最終促進AS的發(fā)展，抑制AngⅡ的活性已被證明能降低心血管疾病的發(fā)病率和病死率〔4〕。AngⅡ信號在調節(jié)血管老化的許多刺激和信號中有關鍵性作用。最近研究表明，AngⅡ可通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活導致血管內(nèi)皮細胞衰老〔5〕。

本實驗結果顯示AngⅡ誘導組內(nèi)皮細胞SA-β-gal活性與對照組相比明顯增高，與本課題組前期研究AngⅡ可呈劑量依賴性直接誘導內(nèi)皮細胞衰老相吻合。AngⅡ誘導血管內(nèi)皮細胞后，流式細胞儀分析細胞周期發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞停滯G0/G1期，而S期及G2/M期趨于消失，表明細胞分裂緩慢，細胞增殖能力逐漸消失，該結果與Unterluggauer等〔6〕報道的內(nèi)皮細胞衰老后細胞周期分布特點相符，說明用AngⅡ誘導的方法已成功復制衰老的HUVECs模型，可用于細胞衰老機制的研究。

整合素αvβ3是與AS相關的重要黏附因子之一。研究表明整合素αvβ3可以介導白細胞〔7〕和嗜酸性粒細胞〔8〕黏附于培養(yǎng)的HUVECs。Bishop等人〔9〕證實在高糖促進單核細胞和白細胞與內(nèi)皮細胞黏附增加的機制中，整合素αvβ3起主要中介作用，杜學良等〔10〕人的研究表明，HG能夠活化內(nèi)皮細胞，使整合素αvβ3表達增加，同時內(nèi)皮細胞與血小板黏附增加。同型半胱氨酸和氧化低密度脂蛋白在切應力作用時，可使血小板與內(nèi)皮細胞的黏附增加2～3倍，這個現(xiàn)象可顯著地被整合素αvβ3拮抗劑所阻斷〔11〕。本研究表明AngⅡ呈時間依賴性地上調整合素αvβ3表達，與文獻結果相吻合。

另有Kim等〔12〕提出AngⅡ作用后的血管內(nèi)皮細胞與單核細胞的黏附作用增加，而且與一些主要的黏附因子如E-selectin，VCAM-1和ICAM-1無關，但與高糖(HG)和弱氧化低密度脂蛋白(mmLDL)促進黏附增加可能通過同一黏附因子。但本課題組前期研究觀察到AngⅡ可呈劑量依賴性地增加E-sel及P-sel的表達。為什么會出現(xiàn)上述結果不一致，主要與各種黏附分子的功能有關，其具體機制有待于進一步研究。

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