肖俊輝 姚 旭* 劉運(yùn)美* 王小平 唐昌云 周 洋 鄭 興*

（1 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；2 南華大學(xué)藥學(xué)科研興趣小組，湖南 衡陽(yáng) 421001）

燈盞乙素又名黃芩素苷（scutellarin），即4'，5，6-三羥基黃酮-7-葡糖醛酸苷，是燈盞花治療腦血管疾病所致癱瘓的主要有效成分，在燈盞花素中一般占90%左右。研究表明，燈盞乙素具有改善微循環(huán)，調(diào)節(jié)血脂，提高心肌功能，清除氧自由基等廣泛的藥理作用[1-4]?，F(xiàn)在市售的燈盞乙素多為純度為90%左右的粗品，為獲得高純度的燈盞乙素，我們分別以大孔樹脂、聚乙酰胺、硅膠為填料，探討通過(guò)柱層析法獲得高純度燈盞乙素的最佳方案。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（日本島津公司LC2010A型）；電子分析天平BT25S（日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI R-124）；CQ250超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；層析柱（2.5×40cm）。

市售燈盞乙素（云南植物藥業(yè)有限公司）；燈盞乙素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；硅膠100～200目，200～300目（中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）；大孔樹酯D-101，AB-8（北京慧德易科技有限公司）；聚乙酰胺30-60目（臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

1.2 填充材料的預(yù)處理

硅膠于105℃烤2h，置干燥器中冷卻；大孔樹脂用乙醇浸泡24h，再水洗至無(wú)醇味；聚乙酰胺乙醇浸泡24h后用10%的醋酸和5%的NaOH處理。

2 方 法

2.1 薄層色譜法（TLC）定性和半定量分析

實(shí)驗(yàn)采用玻璃板為載板，硅膠G為固定相，V（C4H8OH）∶V（CH3COOH）∶V（H2O）=4∶1∶5混合液為流動(dòng)相，碘蒸氣顯色。

2.2 高相液相色譜法（HPLC）

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為V（CH3OH）∶V（0.1%H3PO4）=60∶40，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為335nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL[5-7]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取燈盞乙素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，于比色管中甲醇定容至10mL，即濃度為1mg/mL對(duì)照品溶液。分別取0.25、0.5、1、1.5、2.0、2.5mL稀釋至10ml，配成0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣測(cè)得峰面積。以峰面積（Y）與進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y =1.0×107X-602 511，r=0.9981，線性范圍25.00～250.00μg/mL。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取0.05、0.1、0.2mg/mL的燈盞乙素標(biāo)準(zhǔn)品溶液按上述色譜條件，分別重復(fù)5次。計(jì)算RSD值分別為0.14%、0.18%、0.24%，表明測(cè)定方法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取0.1%標(biāo)準(zhǔn)品液分別與0、1、2、4、6、8h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得RSD值為0.32%，表明燈盞乙素樣品液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附洗脫

取大孔樹脂D-101，AB-8裝柱，精密稱取樣品0.25g，置燒杯中，加NaHCO3/NaOH緩沖液5ml，60℃水浴加熱攪拌至完全溶解，上樣，用10%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至約5mL，加入10倍體積丙酮沉淀，靜置30min，過(guò)濾，沉淀用40%丙酮攪拌溶解，待完全溶解后用稀鹽酸酸化至pH=2，靜置30min，過(guò)濾，濾渣水洗至中性，真空干燥。稱重，HPLC檢測(cè)純度。按上述過(guò)程，大孔樹脂D-101，AB-8各重復(fù)3次，求平均值。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 聚乙酰胺的動(dòng)態(tài)吸附洗脫

取30～60目聚乙酰胺裝柱，精密稱取燈盞乙素樣品1.0g，上樣，分別用不同濃度乙醇梯度洗脫。根據(jù)TLC監(jiān)測(cè)結(jié)果，收集洗脫液。將洗脫液濃縮，真空干燥。稱重，進(jìn)行HPLC分析。按上述過(guò)程，重復(fù)3次，求平均值。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 硅膠的動(dòng)態(tài)吸附洗脫

通過(guò)薄層色譜法比較了不同比例的二氯甲烷、甲醇作流動(dòng)相時(shí)，主成份的比移值Rf、雜質(zhì)組份的比移值Rf′、比移值差ΔRf及相對(duì)比移值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)V（CH2Cl2）∶V（CH3OH）=5∶1時(shí)較適宜硅膠柱的動(dòng)態(tài)吸附洗脫。

分別取100～200目和200～300目硅膠干法裝柱，稱取燈盞乙素樣品0.25g，上樣，V（CH2Cl2）∶V（CH3OH）=5∶1常壓洗脫。根據(jù)TLC監(jiān)測(cè)結(jié)果，收集洗脫液，濃縮，真空干燥。稱重，HPLC分析。按上述過(guò)程，100～200目和200～300目各重復(fù)3次，求平均值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同固定相吸附效果

由表1可以看出：硅膠和大孔樹脂對(duì)燈盞乙素純化效果均較好，但大孔樹脂的產(chǎn)率明顯較硅膠低，且操作步驟繁瑣，易造成原料損失。因此該條件下大孔樹脂用于燈盞乙素的分離精制存在缺陷，而用硅膠柱精制燈盞乙素有如下優(yōu)點(diǎn)：①工藝流程簡(jiǎn)單，且純化效果明顯。②經(jīng)200-300目的硅膠分離后，其純度達(dá)到98%以上，且收率相對(duì)較高。

硅膠柱純化前后成分變化的HPLC分析結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2。

4 結(jié) 論

固定相為200～300目硅膠，流動(dòng)相為V（CH2Cl2）∶V（CH3OH）=5∶1時(shí)，燈盞乙素能獲得較好的純度和收率，且該方法成本低，操作簡(jiǎn)單。

圖1 未處理前樣品的HPLC圖譜

圖2 經(jīng)200～300目硅膠處理后樣品的HPLC圖譜

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