林喜秀瞿樹林周桔張沙駱劉文鋒劉銘

1湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室（長沙410013） 2中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

低氧訓(xùn)練研究始于血液成分[1]。之后，關(guān)于心臟功能[2]、肺通氣量[3]等的研究表明:低氧訓(xùn)練利用低氧刺激保護(hù)機(jī)體，提高機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)氧的能力。不同氧濃度（海拔高度）、低氧刺激時(shí)間、刺激方式等對(duì)機(jī)體細(xì)胞凋亡的影響各異。耐力訓(xùn)練可提高機(jī)體抗疲勞和恢復(fù)能力[4]，抑制細(xì)胞凋亡[5]；急性、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)[6，7]及力竭運(yùn)動(dòng)可引起缺血再灌注損傷，細(xì)胞凋亡增加[8]。

低氧訓(xùn)練時(shí)，機(jī)體既承受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，同時(shí)處于低氧環(huán)境。那么，心、肝、腎、腦組織如何適應(yīng)這種變化?各組織的細(xì)胞凋亡與不同低氧訓(xùn)練刺激時(shí)間的關(guān)系怎樣?低氧訓(xùn)練后力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體不同器官細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究報(bào)道較少。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察低氧訓(xùn)練后力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心、肝、腎、海馬組織細(xì)胞凋亡及HIF-1α、Bcl-2和Bax表達(dá)情況，探討運(yùn)動(dòng)與低氧適應(yīng)的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 分組及實(shí)驗(yàn)方案

70只2～3月齡SD大鼠購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，按體重分層，隨機(jī)分為7組，每組10只，即正常對(duì)照組（A）、高住 8 h 組（B）、高住 12 h 組（C）、常氧運(yùn)動(dòng)組（D）、8 h 高住低練組（E）、12 h 高住低練組（F）和一次力竭運(yùn)動(dòng)組（G）。 D、E、F 組大鼠每天在坡度為0的動(dòng)物跑臺(tái)上以25 m/min的速度訓(xùn)練1 h。每天訓(xùn)練結(jié)束后，將B、E組和C、F組依次放入氧濃度為12.5%（相當(dāng)于海拔4000 m）的低氧艙內(nèi)8 h和12 h。實(shí)驗(yàn)周期為4周，5 d/周。最后一次訓(xùn)練，B、C、D、E、F、G 組均以 25 m/min 的速度跑至力竭。訓(xùn)練中，有時(shí)采用聲、光或毛刷等刺激，偶爾用電刺激，使大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)，保證運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度一致。力竭標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]。實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25±3℃，自然光照，所有動(dòng)物均自由飲食。動(dòng)物及飼料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。

1.2 取材

各組動(dòng)物均于最后一次訓(xùn)練后24 h，采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)的速眠新II（0.8～1.2 ml/kg）腹腔注射麻醉后心臟取血處死，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。剪開腹壁，小心切取切取心尖組織、肝左側(cè)葉、腎皮髓質(zhì)交界處、海馬CA1區(qū)組織。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

美國Hypoxico公司制造的低氧分壓系統(tǒng)，美國TOXIBLAEPGM-36型氧氣監(jiān)測(cè)儀，日本奧林巴斯株式會(huì)社OLYMPUS BX52顯微照相圖像采集系統(tǒng)，美國AO公司AG325R型切片機(jī)。

1.4 測(cè)試指標(biāo)和方法

1.4.1 HE染色

將心、肝、腎、海馬組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1M，pH 7.4）中固定約24 h后，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚5 μm。再按常規(guī)脫蠟、染色、封片。

1.4.2 HIF-1α、Bcl-2及Bax免疫組化染色

HIF-1α、Bcl-2和Bax蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒由北京中杉金橋生物工程有限公司提供，Santa Cruz Biotechnology LNC公司產(chǎn)品。心、肝、腎、海馬組織石蠟切片放于二甲苯5 min×2次；置于100%、95%、85%乙醇中各2 min復(fù)水；自來水沖洗；3%H2O2室溫孵育10 min；蒸餾水沖洗；PBS浸泡5 min；將切片浸入檸檬酸酸鹽抗原修復(fù)液（pH 6.0）后放入微波爐中加熱15 min，間斷2 min后，再加熱5 min；室溫冷卻后經(jīng)PBS沖洗，5 min×3次；正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去；滴加一抗（Bcl-2和Bax均為1?50）；4℃濕盒過夜；次日取出恢復(fù)至室溫后，PBS沖洗5 min×3次；滴加二抗工作液，37℃孵育 30 min；PBS沖洗 5 min×3次；DAB 顯色 5 min；自來水沖洗；蘇木素復(fù)染4 min；自來水沖洗；1%鹽酸酒精分色:自來水沖洗；烤片；封片。HIF-1α蛋白是一種核蛋白，因而在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):棕色或棕褐色顆粒主要顯現(xiàn)在組織細(xì)胞核上。Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，位于胞漿，偶見胞膜（或）核膜，細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色。在光學(xué)顯微鏡（×400）下每張切片隨機(jī)觀察6個(gè)視野（向同一方向移動(dòng)切片，不重復(fù)，不重疊），以Simple PCI圖像分析軟件測(cè)試陽性產(chǎn)物的表達(dá)。采用一定面積中光密度值與陽性面積值的乘積作為陽性指數(shù)（positive index，PI），即陽性指數(shù)=陽性強(qiáng)度光密度值×陽性反應(yīng)面積/測(cè)量面積[10]。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法 （terminal deoxynucleotydyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。心、肝、腎、海馬組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化；抗原修復(fù)；內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷；標(biāo)記；信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析；顯色；復(fù)染；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。普通光學(xué)顯微鏡觀察，陽性凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕色或棕褐色著染，部分胞漿也可因胞核DNA碎片溢出而呈陽性著染；正常非凋亡細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色，核相對(duì)較大，形態(tài)大小一致。

用Motic B5顯微攝像系統(tǒng)和MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)攝像計(jì)數(shù)。光學(xué)顯微鏡（×400）下每張切片隨機(jī)觀察6個(gè)視野，每個(gè)視野至少500個(gè)細(xì)胞水平，以Simple PCI顯微圖像分析軟件計(jì)算每100個(gè)觀察細(xì)胞中的平均陽性凋亡細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間

表1顯示，兩高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h高住低練組的運(yùn)動(dòng)時(shí)間比12 h高住低練組及一次力竭運(yùn)動(dòng)組明顯延長，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間比較

2.2 大鼠心、肝、腎、海馬組織HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組和高住8 h組大鼠心、肝、腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。高住12 h組、常氧運(yùn)動(dòng)組和8 h高住低練組心尖、肝、腎小球、腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見明顯改變，組織細(xì)胞形態(tài)無異常改變。一次力竭運(yùn)動(dòng)組和12 h高住低練組心、肝細(xì)胞明顯腫脹，間隙明顯增大，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，集聚于核膜周邊，細(xì)胞體變?。荒I小管上皮細(xì)胞水腫樣變性，以近曲小管為重，腎小管管腔擴(kuò)張，管內(nèi)可見管形和脫落細(xì)胞；上皮細(xì)胞核染色質(zhì)集聚周邊，胞漿空泡樣變性（見圖1所示）。常氧運(yùn)動(dòng)組和一次力竭運(yùn)動(dòng)組海馬CA1區(qū)組織改變最明顯，排列散亂，層次不完整，稀疏分布不均勻。

2.3 大鼠心、肝、腎、海馬TUNEL結(jié)果

圖2顯示:隨低氧時(shí)間延長，心組織凋亡細(xì)胞逐漸增多。高住8 h組偶見陽染顆粒，高住12 h組陽染顆粒有所增加，12 h高住低練組出現(xiàn)較多散在的陽染顆粒；8 h高住低練組海馬區(qū)可見較多陽性凋亡細(xì)胞，隨低氧時(shí)間延長，海馬組織凋亡細(xì)胞減少。

表2 各組大鼠心、肝、腎、海馬組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）比較（%）

表2顯示:與正常對(duì)照組相比，高住12 h組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h高住低練組和一次力竭運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎凋亡指數(shù)均顯著增加（P<0.05），而 8 h、12 h高住低練組海馬組織與正常對(duì)照組相比升高但無顯著性差異。12小時(shí)高住低練組海馬凋亡指數(shù)與常氧運(yùn)動(dòng)組比較顯著增加（P<0.05）；與一次力竭運(yùn)動(dòng)相比，高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h高住低練組海馬區(qū)凋亡指數(shù)均明顯降低（P<0.05）。12小時(shí)高住低練組心、肝、腎凋亡指數(shù)較8小時(shí)高住組顯著增加（P<0.05）。

2.4 大鼠心、肝、腎、海馬Bax、Bcl-2及HIF-1α 免疫組化染色圖像觀察結(jié)果

2.4.1 Bax

Bax蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿，也可見細(xì)胞膜和細(xì)胞漿同時(shí)著色，呈淡棕黃色或棕色，呈鏃狀分布和（或）片狀分布。在顯微鏡下觀察，將切片內(nèi)陽性細(xì)胞率<10%定為陰性顯色，丟棄，不進(jìn)行照像和分析處理；將切片內(nèi)陽性細(xì)胞率≥10%定為陽性顯色，進(jìn)行照像并采集數(shù)據(jù)分析。

常氧對(duì)照組偶見非常淺的Bax蛋白陽性物質(zhì)，灰度較弱；低氧對(duì)照組陽性表達(dá)增多，細(xì)胞膜上也有少量表達(dá)；常氧運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎組織胞漿和胞膜可見較多Bax蛋白表達(dá)，呈鏃狀、片狀分布；高住低練8 h組心、肝、腎細(xì)胞漿可見較多陽性物；高住低練12 h組及一次力竭運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎細(xì)胞漿和細(xì)胞膜均有陽性物質(zhì)，面積較大，呈鏃狀、片狀分布（見圖3腎組織）；而正常對(duì)照組、低氧8 h組和低氧12 h組海馬組織CA1區(qū)Bax陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)增多；常氧運(yùn)動(dòng)組、一次力竭運(yùn)動(dòng)組可見大量陽性細(xì)胞，8h高住低練組和12h高住低練組海馬組織CA1區(qū)Bax陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸減少（見圖3海馬CA1區(qū)）。

由表3可知，與正常對(duì)照組相比，高住12 h組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h和12 h高住低練組和一次力竭運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎組織Bax蛋白表達(dá)陽性指數(shù)均顯著增加（P<0.05），而8 h和12 h高住低練組海馬區(qū)與正常對(duì)照組相比增高但無顯著性差異。12 h高住低練組心、肝、腎組織Bax蛋白表達(dá)與常氧運(yùn)動(dòng)組比較顯著增加（P<0.05）；與一次力竭運(yùn)動(dòng)組相比，高住8 h組、高住12 h組、常氧運(yùn)動(dòng)組和8 h高住低練組海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)陽性指數(shù)均顯著降低 （P<0.05）。12 h高住低練組心、肝、腎Bax蛋白表達(dá)陽性指數(shù)比8 h高住組顯著增加（P<0.05），海馬區(qū)則無顯著性差異。

表3 各組大鼠心、肝、腎、海馬組織Bax蛋白表達(dá)陽性指數(shù)（PI）比較

2.4.2 Bcl-2

Bcl-2蛋白陽性信號(hào)主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，為棕黃色，略呈顆粒狀。對(duì)照組、低氧8 h組和低氧12 h組心、肝、腎組織Bcl-2陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸增多；常氧運(yùn)動(dòng)組、8h高住低練組和12h高住低練組心、肝、腎Bcl-2陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸減少（見圖4腎組織）。正常對(duì)照組、高住8h組和高住12h組海馬組織CA1區(qū)Bcl-2陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸減少，訓(xùn)練對(duì)照組、8h高住低練組和12h高住低練組海馬組織CA1區(qū)Bcl-2陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸增多 （見圖4海馬CA1區(qū)）。

表4顯示。與正常對(duì)照組相比，8 h和12 h高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h和12 h高住低練組和一次力竭運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎Bcl-2蛋白表達(dá)陽性指數(shù)均顯著增加（P<0.05），而8 h和12 h高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、一次力竭運(yùn)動(dòng)組海馬組織Bcl-2蛋白表達(dá)陽性指數(shù)顯著下降 （P<0.05）；與一次力竭運(yùn)動(dòng)組相比，8 h和12 h高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8h高住低練組心、肝、腎、海馬Bcl-2蛋白表達(dá)陽性指數(shù)均顯著增加 （P<0.05）；12 h高住低練組海馬Bcl-2蛋白表達(dá)陽性指數(shù)較8小時(shí)高住組顯著增加（P<0.05）。

2.4.3 HIF-1α

常氧運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎組織可見HIF-1α免疫陽性物質(zhì)表達(dá)；8 h高住低練組陽性物質(zhì)較多，主要表達(dá)于胞漿中，部分在胞核中；12 h高住低練組和一次力竭運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎組織可見大量HIF-1α免疫陽性物質(zhì)，主要表達(dá)于胞漿中，部分在胞核中。正常對(duì)照組、低氧8 h組和低氧12 h組海馬組織CA1區(qū)HIF-1α陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸增多，8 h高住低練組和12 h高住低練組海馬組織HIF-1α陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸減少。圖5顯示:心肌組織對(duì)照組偶見較弱的HIF-1α免疫陽性表達(dá)；高住8 h組陽性物質(zhì)主要表達(dá)于胞漿中，部分在胞核中，并分布于心肌纖維、肝竇靜脈及腎小管周圍；高住12 h組陽性物質(zhì)較強(qiáng)表達(dá)，主要位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)也少量表達(dá)。

表4 各組大鼠心、肝、腎、海馬組織Bcl-2蛋白表達(dá)陽性指數(shù)（PI）比較

表5顯示，與正常對(duì)照組相比，高住12 h組、常氧運(yùn)動(dòng)組、高住低練組和一次力竭運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)陽性指數(shù)均顯著增加 （P<0.05），而高住低練組海馬區(qū)有所增高但無顯著性差異。與常氧運(yùn)動(dòng)組比較，12 h高住低練組心、肝、腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)陽性指數(shù)顯著增加（P<0.05），海馬組織區(qū)與之相反；與一次力竭運(yùn)動(dòng)組相比，高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組和8 h高住低練組心、肝、腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)陽性指數(shù)均明顯降低 （P<0.05）；12 h高住低練組心、肝、腎Bax蛋白表達(dá)陽性指數(shù)比8 h高住組顯著增加（P<0.05），海馬組織與之相反。

3 討論

3.1 高住低練后力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心、肝、腎、海馬細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞異常凋亡在急、慢性器官損害的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[11]。低氧、運(yùn)動(dòng)及低氧運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞凋亡存在某種直接或者間接的聯(lián)系[12，13]。 研究表明，低氧對(duì)不同組織細(xì)胞凋亡影響不同。缺氧可以誘導(dǎo)交感神經(jīng)細(xì)胞凋亡[14]，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞具有直接的致細(xì)胞凋亡作用[15]；而抑制肺血管周細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)抑凋亡基因Bcl-2過度表達(dá)[16]；胸腺細(xì)胞在低氧狀態(tài)下自發(fā)性凋亡減少[17]；Tanaka 等[18]研究培 養(yǎng)的新生鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在低氧12小時(shí)即可出現(xiàn)，并隨低氧時(shí)間延長逐漸加重；Kohli等[19]建立大鼠常溫肝臟缺血再灌注模型后，發(fā)現(xiàn)肝缺血再灌注損傷的肝細(xì)胞和肝竇狀上皮細(xì)胞的死亡方式主要以細(xì)胞凋亡方式存在，而非傳統(tǒng)的細(xì)胞壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，12 h高住組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，8 h高住組細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，但無顯著性差異；與一次力竭運(yùn)動(dòng)組比，8 h、12 h高住組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低。HE染色結(jié)果表明，8 h高住組心、肝、腎、海馬各組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，組織上皮細(xì)胞未見特殊改變，12 h高住組各組織細(xì)胞未出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)改變，而一次力竭運(yùn)動(dòng)組各組織出現(xiàn)明顯病理損傷。這表明4000 m低氧暴露4周后，機(jī)體產(chǎn)生了抗損傷力，使低氧暴露后力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的損傷明顯小于單純一次力竭運(yùn)動(dòng)。缺氧引起的機(jī)能變化有損傷一面，也有抗損傷一面，關(guān)鍵在缺氧發(fā)生的速度、程度、持續(xù)時(shí)間等。模擬海拔4000 m低氧4周后，高住8 h和12 h組心、肝、腎小管、海馬無明顯損傷，可能是氧分壓適宜，或每次低氧持續(xù)時(shí)間、4周低氧適應(yīng)時(shí)間恰當(dāng)。這說明4000 m低氧暴露8 h或12 h作為應(yīng)激源作用強(qiáng)度較緩和，作用時(shí)間恰當(dāng)，能提高機(jī)體機(jī)能和運(yùn)動(dòng)能力。

表5 各組大鼠心、肝、腎、海馬組織HIF-1α蛋白表達(dá)陽性指數(shù)（PI）比較

適宜運(yùn)動(dòng)提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，未見凋亡明顯發(fā)生[20]。急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞數(shù)目隨著運(yùn)動(dòng)速度增加而增加，過度疲勞時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)壞死，力竭訓(xùn)練可導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞[21]、海馬[22]、腎[23]凋亡率顯著升高。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:常氧運(yùn)動(dòng)組可見較多的凋亡細(xì)胞核，其凋亡指數(shù)顯著低于一次力竭運(yùn)動(dòng)組；HE染色結(jié)果中，常氧運(yùn)動(dòng)組心、肝、腎、海馬各組織上皮細(xì)胞未見明顯病理改變，而一次力竭運(yùn)動(dòng)組各組織出現(xiàn)明顯損傷。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)，血液重新分配，大量供給骨骼肌，心、肝、腎及腦組織不可避免缺血缺氧，運(yùn)動(dòng)停止后，血液再次重新分配，心、肝、腎及腦組織經(jīng)歷類似缺血再灌注的過程。Cosulich研究[24]表明，這種血流恢復(fù)反而引起細(xì)胞的進(jìn)行性破壞，即再灌注損傷，導(dǎo)致缺血組織損傷。再灌注損傷由多種原因引起，啟動(dòng)自由基連鎖反應(yīng)，氧自由基可通過引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、損傷DNA分子或者調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后力竭運(yùn)動(dòng)，機(jī)體有一個(gè)長時(shí)間的適應(yīng)過程，力竭運(yùn)動(dòng)后缺血再灌注程度相對(duì)較輕，凋亡機(jī)制的啟動(dòng)可能受到限制，說明中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。

低氧暴露與運(yùn)動(dòng)雙重刺激對(duì)心、肝、腎、海馬細(xì)胞凋亡的影響如何？本實(shí)驗(yàn)中，鏡下凋亡細(xì)胞呈深棕色陽性，核中有細(xì)微顆粒狀，部分胞漿也因細(xì)胞核DNA碎片溢出而呈陽性著色，而正常細(xì)胞胞核呈藍(lán)色。正常對(duì)照組心、肝、腎組織偶見陽性細(xì)胞核；高住低練組陽性細(xì)胞核較多，特別是12 h高住低練組及一次力竭運(yùn)動(dòng)組，呈強(qiáng)陽性；一次力竭運(yùn)動(dòng)組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8h高住低練組和12 h高住低練組海馬組織CA1區(qū)深棕色陽性細(xì)胞核隨低氧持續(xù)時(shí)間延長而表達(dá)減少。與正常對(duì)照組相比，8 h、12 h高住低練組心、肝、腎細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，12 h高住低練組比8 h、12 h高住組和常氧運(yùn)動(dòng)組均顯著升高。12 h高住低練組HE染色可見明顯病理損傷，力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯減少。12 h高住低練組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于8h高住低練組，說明4000 m低氧暴露12 h后再進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，負(fù)荷性缺氧與低氧性缺氧兩者對(duì)心、肝、腎有協(xié)同效應(yīng)。運(yùn)動(dòng)（負(fù)荷性低氧或運(yùn)動(dòng)性缺氧）和低氧暴露（缺氧性低氧或低氧性缺氧）后運(yùn)動(dòng)，心、肝、腎可能出現(xiàn)暫時(shí)缺血[25，26]，強(qiáng)度降低后血液重新回流，導(dǎo)致再灌注損傷。 Mattson[27]觀察到，短暫腦缺血后，幾分鐘至幾小時(shí)內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)元看似正常，但48～72 h后大多死亡，提示短暫腦缺血時(shí)，神經(jīng)元凋亡主要發(fā)生于缺血敏感區(qū)，如海馬、紋狀體等。本研究中，常氧運(yùn)動(dòng)組海馬區(qū)可見細(xì)胞凋亡，但與一次性力竭運(yùn)動(dòng)相比明顯降低，說明中等強(qiáng)度耐力訓(xùn)練提高機(jī)體抗細(xì)胞凋亡能力，有保護(hù)機(jī)體的作用，8 h和12 h高住低練組凋亡細(xì)胞指數(shù)隨低氧持續(xù)時(shí)間延長有減少趨勢(shì)，推測(cè)是大腦對(duì)低氧刺激的適應(yīng)性改變。在低氧訓(xùn)練中，大腦攜氧能力較單純運(yùn)動(dòng)組高。這說明4周高住低練后力竭運(yùn)動(dòng)，使停止運(yùn)動(dòng)后缺氧再灌注的變化幅度比單純一次力竭運(yùn)動(dòng)組小得多，海馬組織損害也減小，表現(xiàn)為8 h和12 h低氧訓(xùn)練組細(xì)胞凋亡指數(shù)較常氧運(yùn)動(dòng)組均降低，且隨低氧適應(yīng)時(shí)間的延長有減小的趨勢(shì)。

高住低練后力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制有:①一方面細(xì)胞內(nèi)游離鈣超載激活鈣離子依賴性的核酸內(nèi)切酶，使雙鏈DNA在核小體Linker部位裂解，形成DNA片段；另一方面鈣超載可激活蛋白酶C，令其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜表面，使G蛋白磷酶化，胞內(nèi)cAMP 增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]；②Bcl-2 和 Bax 與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。Bcl-2水平高于Bax時(shí)，形成Bcl-2和Bcl-2同源二聚體，細(xì)胞凋亡受抑制；Bax表達(dá)高于Bcl-2時(shí)，則形成Bax和Bax同源二聚體，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。并且，Bcl-2和Bax定位于線粒體膜上，這為其調(diào)控細(xì)胞凋亡提供了條件；③低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）作為低氧條件下機(jī)體的調(diào)節(jié)因子，可能在體內(nèi)發(fā)揮多向性調(diào)節(jié)作用。其除了發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡方面的作用，它還介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；④P53是介導(dǎo)HIF-1發(fā)揮促凋亡作用的重要分子。免疫共沉淀等方法證明，HIF-1直接與P53蛋白結(jié)合，增加P53穩(wěn)定性，促進(jìn)P53發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用[29]；⑤機(jī)體不同組織本身具有的特點(diǎn)可能與低氧運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致其細(xì)胞凋亡有一定關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，12 h高住低練對(duì)大腦海馬組織無明顯影響，海馬組織對(duì)低氧刺激反應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定，而心、肝、腎對(duì)低氧刺激反應(yīng)較大，出現(xiàn)明顯病理改變。

3.2 高住低練大鼠心、肝、腎、海馬細(xì)胞凋亡與HIF-1α及Bax/Bcl-2關(guān)系

3.2.1 高住低練對(duì)大鼠心、肝、腎、海馬組織HIF-1α表達(dá)的影響

低氧誘導(dǎo)因子可調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[30]等誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的許多生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)，它有雙重效應(yīng)，輕度低氧時(shí)，促進(jìn)其目的基因如促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子生成，促進(jìn)低氧組織細(xì)胞存活，具有抗凋亡的功能；嚴(yán)重低氧且持續(xù)時(shí)間長時(shí)，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子如Bax、Bad等，激活Caspases，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的凋亡，即HIF-1的激活影響細(xì)胞增殖和凋亡[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:8 h和12 h高住組、常氧運(yùn)動(dòng)、高住低練后力竭運(yùn)動(dòng)或者一次力竭運(yùn)動(dòng)，都能促進(jìn)心、肝、腎HIF-1a蛋白表達(dá)顯著增加；與單純低氧暴露組相比，高住低練組HIF-1α蛋白表達(dá)高些；與常氧運(yùn)動(dòng)組比較，高住低練組表達(dá)更顯著，且12 h高住低練組心、肝、腎組織表達(dá)最高；與一次力竭運(yùn)動(dòng)相比，8 h和12 h高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h高住低練組HIF-1α蛋白表達(dá)均明顯降低。而海馬HIF-1α表達(dá)與之相反，高住12 h組HIF-1α表達(dá)最高，高住低練組表達(dá)顯著增加，與一次力竭運(yùn)動(dòng)無顯著差異，高住低練組及一次力竭運(yùn)動(dòng)組表達(dá)高于單純低氧暴露組和常氧運(yùn)動(dòng)組。這表明HIF-1α對(duì)外界形成的低氧產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，細(xì)胞通過多個(gè)通路感受低氧，調(diào)控HIF-1α表達(dá)，穩(wěn)定其活性，可為減輕低氧對(duì)器官造成的損傷提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2.2 高住低練對(duì)大鼠心、肝、腎、海馬細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2的影響

Bcl-2、Bax基因主要在凋亡執(zhí)行階段發(fā)揮作用，Bcl-2/Bax蛋白比值決定細(xì)胞是存活還是凋亡，Bcl-2/Bax比值高，細(xì)胞存活率高，反之，細(xì)胞凋亡率高[32]。 Campbell等[33]研究表明，12 周訓(xùn)練促進(jìn) Bax 蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，Bcl-2表達(dá)下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[34]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，低氧暴露、常氧運(yùn)動(dòng)、高住低練及一次力竭運(yùn)動(dòng)，均促進(jìn)心、肝、腎Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著增加；單純低氧暴露下，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，隨低氧暴露時(shí)間延長，Bcl-2無顯著增加，8h低氧暴露組Bax蛋白表達(dá)稍低于12 h組；常氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著增加；高住低練促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，隨著低氧暴露時(shí)間延長，增加不明顯，但仍顯著高于正常對(duì)照組；高住低練組Bax蛋白含量比低氧暴露組顯著增加，與常氧運(yùn)動(dòng)組相比也顯著增加，隨低氧暴露時(shí)間延長呈增長趨勢(shì)。海馬組織與之相反；與一次力竭運(yùn)動(dòng)組比，8 h和12 h高住組、常氧運(yùn)動(dòng)組、8 h高住低練組Bax蛋白表達(dá)值均明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加。Bcl-2蛋白過表達(dá)并不增加細(xì)胞數(shù)而是保護(hù)細(xì)胞、延長細(xì)胞壽命。本實(shí)驗(yàn)中，Bax蛋白表達(dá)明顯上升，Bax/Bcl-2比值增加，消除Bcl-2對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起機(jī)體損傷。大鼠力竭時(shí)間卻顯著延長，與Bcl-2蛋白表達(dá)增加一致，反映耐力訓(xùn)練、低氧暴露、高住低練提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，Bcl-2/Bax比值增加，保護(hù)機(jī)體免受損傷。

3.2.3 高住低練心、肝、腎、海馬細(xì)胞凋亡與HIF-1α及凋亡相關(guān)因子之間的關(guān)系

Helton[35]和 Rosenberger[36]研 究 表明 ，HIF-1 在大鼠腎缺血再灌注病理損傷中發(fā)揮重要作用。HIF-1α的激活使其蛋白表達(dá)增加，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、P53基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1α在低氧暴露、常氧運(yùn)動(dòng)、低氧訓(xùn)練作用或一次力竭運(yùn)動(dòng)中上調(diào)Bax，提高Bax/Bcl-2，協(xié)同Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，在低氧導(dǎo)致心、肝、腎、海馬細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用。12 h高住低練組及一次力竭運(yùn)動(dòng)組最明顯，表現(xiàn)出HIF-1α在低氧環(huán)境中的病理效應(yīng)。而高住8 h組、高住12 h組、常氧運(yùn)動(dòng)組HIF-lα表達(dá)協(xié)同Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用，表現(xiàn)出HIF-1α在低氧環(huán)境中的生理效應(yīng)，提示HIF-1α有雙重效應(yīng)。但HIF-1α雙重效應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待于研究。

4 總結(jié)

中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)、4000 m低氧暴露8 h或12 h、8 h高住低練提高大鼠有氧代謝能力。低氧、耐力運(yùn)動(dòng)、高住低練、一次力竭運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)大鼠心、肝、腎、海馬組織HIF-1a、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)；細(xì)胞凋亡率與凋亡指數(shù)及病理損傷與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、低氧刺激有關(guān)，12 h高住低練及一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的影響最明顯。Bcl-2與Bax參與調(diào)控心、肝、腎、海馬組織細(xì)胞凋亡，HIF-1a表達(dá)可能協(xié)同Bcl-2家族凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，在低氧訓(xùn)練導(dǎo)致的組織細(xì)胞凋亡中發(fā)揮雙重效應(yīng)。低氧刺激對(duì)不同器官影響不一，對(duì)大腦海馬組織影響較小，而對(duì)心、肝、腎影響較大，表現(xiàn)生理性適應(yīng)及病理損傷。

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