荊立忠 郭秦?zé)?胡躍林

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）

修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損尤其是重度缺損始終是臨床醫(yī)師面對(duì)的棘手難題。其主要手術(shù)方法包括鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)、自體骨軟骨移植術(shù)以及軟骨細(xì)胞移植術(shù)等[1-3]。但每種術(shù)式均有缺點(diǎn):鉆孔術(shù)及微骨折術(shù)不適用于大面積的軟骨缺損和嚴(yán)重的骨軟骨損傷；骨軟骨移植術(shù)容易造成供區(qū)關(guān)節(jié)軟骨損傷從而影響供區(qū)關(guān)節(jié)功能；軟骨細(xì)胞移植術(shù)費(fèi)用昂貴且需行二次手術(shù)等[4]。近年來(lái)，一些學(xué)者將髂軟骨作為軟骨修復(fù)的組織來(lái)源[5，6]，從而克服了上述各種術(shù)式的缺點(diǎn)。但髂軟骨的性質(zhì)及隨年齡增長(zhǎng)的變化特點(diǎn)，目前缺乏相關(guān)的詳細(xì)研究。本實(shí)驗(yàn)觀察了不同年齡階段家兔髂軟骨的組織學(xué)特征，并與相應(yīng)年齡階段的膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行比較，研究其與關(guān)節(jié)軟骨在組織結(jié)構(gòu)方面的異同點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大白兔15只，1月齡、3月齡、4月齡、6月齡、12月齡各3只。雌雄不限。

1.2 標(biāo)本的處理

分別用骨刀切取每只家兔的兩側(cè)髂軟骨及少量軟骨下骨和1月齡、3月齡和12月齡組膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨標(biāo)本各1塊，直徑4 mm、厚度6 mm，將標(biāo)本修切整齊，用于組織學(xué)分析:取材后馬上浸入4%多聚甲醛（solarbio公司）固定48小時(shí)，生理鹽水沖洗，然后放入10%甲酸脫鈣液脫鈣7～10天，石蠟包埋后切片，厚度5 mm。

1.3 組織化學(xué)染色

分別將各組髂軟骨和關(guān)節(jié)軟骨的切片脫蠟，進(jìn)行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色。

1.4 免疫組化染色

小鼠抗兔I型膠原單克隆抗體、小鼠抗兔II型膠原多克隆抗體均購(gòu)自Calbiochem公司。山羊抗小鼠第二抗體（PV-6002）及胃蛋白酶均購(gòu)自中杉金橋公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自基因科技公司。

分別將各年齡段髂軟骨和關(guān)節(jié)軟骨的切片脫蠟，恢復(fù)室溫后，用胃蛋白酶處理（37℃，30分鐘），然后分別滴加抗I型及II型第一抗體 （濃度均為1:200，37℃，2小時(shí)）。 DAB法顯色，陽(yáng)性結(jié)果為棕色。各組均用PBS代替第一抗體作為免疫組化染色陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Image-Pro PLUS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)軟骨標(biāo)本進(jìn)行成像，分別測(cè)量軟骨厚度（μm）及細(xì)胞密度（個(gè)/10000μm2）。 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組之間采用t檢驗(yàn)，多組之間采用單因素方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)染色

關(guān)節(jié)軟骨主要由透明軟骨細(xì)胞組成。隨著年齡的增長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞密度逐漸下降，軟骨層厚度逐漸變薄，肥大層及鈣化層逐步出現(xiàn)細(xì)胞骨化。甲苯胺藍(lán)染色變淺。II型膠原免疫組化染色陽(yáng)性（圖1）。按表層、移行層、柱狀層、肥大層、鈣化層分層后對(duì)每層厚度及細(xì)胞密度進(jìn)行測(cè)量，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 各年齡組關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)染色結(jié)果（×40）

表1 關(guān)節(jié)軟骨厚度及細(xì)胞密度隨年齡增長(zhǎng)的變化

2.2 髂軟骨的組織學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 1月齡標(biāo)本

HE染色可見(jiàn)，淺表層及中間層有大量軟骨細(xì)胞，形態(tài)主要為圓形，體積較小，軟骨細(xì)胞分布均勻，內(nèi)無(wú)細(xì)胞肥大及鈣化現(xiàn)象；深層軟骨細(xì)胞呈扁平型，細(xì)胞長(zhǎng)徑垂直于骨之長(zhǎng)軸，同源細(xì)胞群呈長(zhǎng)串狀，與髂骨縱軸平行排列；鈣化軟骨層較窄，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)呈空泡狀。甲苯胺藍(lán)染色均勻，無(wú)失染現(xiàn)象。II型膠原免疫組化染色陽(yáng)性，I型膠原免疫組化染色陰性。

2.2.2 3月齡標(biāo)本

HE染色可見(jiàn)，淺表層及中間層變薄，部分區(qū)域出現(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞，大而圓，三五成群；深層長(zhǎng)串狀的同源細(xì)胞群相對(duì)變少。肥大軟骨細(xì)胞區(qū)甲苯胺藍(lán)染色缺失。肥大軟骨細(xì)胞區(qū)II型膠原免疫組化染色陰性，其余區(qū)域染色陽(yáng)性。軟骨區(qū)I型膠原免疫組化染色陰性，軟骨下骨I型膠原免疫組化染色陽(yáng)性。

2.2.3 4月齡標(biāo)本

圖2 各年齡組髂軟骨組織學(xué)染色結(jié)果（×40）

HE染色可見(jiàn)，淺表層及中間層部分區(qū)域出現(xiàn)散在骨化灶；深層長(zhǎng)串狀的同源細(xì)胞群變少。骨化區(qū)甲苯胺藍(lán)染色缺失。骨化區(qū)II型膠原免疫組化染色陰性，其余軟骨區(qū)域染色陽(yáng)性。軟骨區(qū)I型膠原免疫組化染色陰性，骨化區(qū)及軟骨下骨I型膠原免疫組化染色陽(yáng)性。

2.2.4 6月齡標(biāo)本

HE染色可見(jiàn)，淺表層及中間層軟骨幾乎全部骨化，軟骨細(xì)胞稀少；深層長(zhǎng)串狀的同源細(xì)胞群變短、變稀，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少；鈣化軟骨層部分細(xì)胞出現(xiàn)骨化，細(xì)胞數(shù)量減少。骨化區(qū)甲苯胺藍(lán)染色缺失。骨化區(qū)II型膠原免疫組化染色陰性，其余區(qū)域染色陽(yáng)性。軟骨區(qū)I型膠原免疫組化染色陰性，骨化區(qū)及軟骨下骨I型膠原免疫組化染色陽(yáng)性。

2.2.5 12月齡標(biāo)本

HE染色見(jiàn)軟骨層缺失，軟骨幾乎全部骨化；甲苯胺藍(lán)染色淺染，II型膠原免疫組化染色弱陽(yáng)性，染色區(qū)域窄，I型膠原免疫組化染色陽(yáng)性。

3 討論

髂軟骨是肌腱在髂骨處的附著點(diǎn)，屬于特殊類型的牽拉性軟骨[7]，其骨化后表面即成為肌腱止點(diǎn)。作為肌肉附著于骨面的著力點(diǎn)，肌腱止點(diǎn)不僅要把肌肉的收縮力量完全傳遞到效應(yīng)骨上，還要有應(yīng)力緩沖作用[8]，這就可以理解髂軟骨存在的意義。

Ponseti等[7]通過(guò) HE組織學(xué)染色初步研究、比較了人體髂軟骨在組織形態(tài)學(xué)及化學(xué)成分上的異同，研究集中在兒童到青少年階段，作者研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒的髂軟骨主要由透明軟骨組成。青年期開(kāi)始出現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大、骨化現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)欠缺之處在于作者未進(jìn)一步對(duì)比成年標(biāo)本，也未深入全面地將其與關(guān)節(jié)軟骨加以對(duì)比。此后，利用髂軟骨修復(fù)各種關(guān)節(jié)軟骨缺損屢見(jiàn)報(bào)道[5，6]，髂軟骨也廣泛應(yīng)用于修復(fù)多種顏面部缺損畸形[9]，均取得較滿意的結(jié)果。但髂軟骨的性質(zhì)以及隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)的變化，相關(guān)學(xué)者并未繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

本研究中，關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)特點(diǎn)及其隨年齡出現(xiàn)的變化規(guī)律與其他有關(guān)學(xué)者的研究[10]一致:隨著年齡增長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞密度逐漸下降，細(xì)胞體積增大，軟骨層厚度逐漸變薄。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步按表層、移行層、柱狀層、肥大層、鈣化層對(duì)每層厚度及每層軟骨細(xì)胞密度隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)的變化進(jìn)行了描述，從而更加全面地闡述了其變化規(guī)律。另外，隨著年齡增長(zhǎng)，甲苯胺藍(lán)染色也稍微變淺，這可能與基質(zhì)合成能力下降有關(guān)。肥大層及鈣化層出現(xiàn)鈣化，但正常條件下表層、移行層、柱狀層無(wú)軟骨鈣化。

與關(guān)節(jié)軟骨類似，髂軟骨也主要由透明軟骨細(xì)胞組成，基本可劃分為淺表層、中間層、深層以及鈣化層。但與關(guān)節(jié)軟骨不同的是，隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大及骨化現(xiàn)象的主要為淺表層及中間層，首先是淺表層及中間層不同部位出現(xiàn)數(shù)個(gè)小的骨化灶，至成年期骨化灶連成一個(gè)整體，最終整個(gè)軟骨層幾乎全部骨化。由幼年到成年，甲苯胺藍(lán)染色以及II型膠原免疫組織化學(xué)染色均逐漸變淺；I型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示其只在軟骨下骨及肌腱部位著色，成年后隨著軟骨出現(xiàn)骨化，I型膠原在骨化區(qū)著色。如實(shí)驗(yàn)所述，成年后各透明軟骨相關(guān)指標(biāo)雖然都有所下降，但仍有II型膠原蛋白的合成及蛋白粘多糖、硫酸軟骨素的分泌，而這些指標(biāo)正是透明軟骨所特有的。

與髂軟骨類似，髕尖末端結(jié)構(gòu)也屬于牽拉性軟骨的一種。丁長(zhǎng)隆等[8]在對(duì)其進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)在有些老年髕尖末端結(jié)構(gòu)內(nèi)，部分老化纖維軟骨細(xì)胞反分化為透明軟骨細(xì)胞形成透明軟骨島，原有的纖維軟骨細(xì)胞幾乎不可見(jiàn)。關(guān)于其發(fā)生原因，作者推測(cè)可能為各種因素致使局部細(xì)胞環(huán)境發(fā)生改變，刺激老化細(xì)胞發(fā)生反分化，再由這種分化較低的細(xì)胞分化成透明軟骨島。近年來(lái)大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子均能使肥大骨化的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)反分化[11，12]，我們推測(cè)，上述細(xì)胞出現(xiàn)反分化的原因可能與局部生長(zhǎng)因子的作用有關(guān)。如果推測(cè)成立，生長(zhǎng)因子對(duì)同為牽拉性軟骨的髂軟骨有無(wú)類似作用將值得進(jìn)一步探討。

總之，髂軟骨有希望成為軟骨缺損的修復(fù)材料，結(jié)合其具有手術(shù)操作簡(jiǎn)單、來(lái)源充足、無(wú)關(guān)節(jié)供區(qū)損傷等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行全面深入研究將為軟骨缺損修復(fù)領(lǐng)域開(kāi)辟新思路，進(jìn)而有助于解決大面積關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的難題。但移植到軟骨缺損區(qū)后會(huì)不會(huì)發(fā)生骨化以及如何克服此種弊端，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 總結(jié)

家兔幼年期髂軟骨類似于關(guān)節(jié)透明軟骨，但隨著年齡的增長(zhǎng)，髂軟骨細(xì)胞逐漸肥大、骨化，至成年期仍有少量透明軟骨細(xì)胞特有的II型膠原蛋白及蛋白多糖的合成。

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