李宏云 陳世益 張健 李云霞

復(fù)旦大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中心 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與關(guān)節(jié)鏡外科（上海200040）

骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中常見的損傷之一，占運(yùn)動(dòng)損傷的10%～50%[1]。骨骼肌損傷后再生能力有限，結(jié)構(gòu)及功能恢復(fù)常常不完全，愈合緩慢，并伴有一定程度的纖維化，易再次發(fā)生損傷。研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪丹參復(fù)方注射液在形態(tài)學(xué)上可加快骨骼肌損傷愈合，促進(jìn)肌球蛋白重鏈的表達(dá)和合成，抑制膠原纖維合成，增強(qiáng)骨骼肌收縮力[2-4]。然而，黃芪丹參復(fù)方制劑組成成分繁雜，作用機(jī)制尚未完全明確，阻礙了其在骨骼肌損傷治療中的大規(guī)模臨床應(yīng)用和國際化推廣。黃芪皂甙和丹參酮ⅡA是黃芪和丹參的重要組成成分，我們前期的研究工作已表明急性骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中，黃芪皂甙和丹參酮ⅡA能有效地促進(jìn)胚胎型肌球蛋白重鏈 （embryonic Myosin Heavy Chain，MHC-emb）mRNA 的表達(dá)，同時(shí)抑制波形蛋白（vimentin）mRNA的表達(dá)，聯(lián)合注射作用與黃芪丹參復(fù)方注射液效果相似[5]。但是，由于組織功能的執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，從mRNA到蛋白質(zhì)還需要翻譯過程。因此有必要進(jìn)一步了解該藥對(duì)MHC-emb和vimentin蛋白表達(dá)水平的影響，來充分了解黃芪皂甙和丹參酮ⅡA在骨骼肌損傷修復(fù)過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重180～200g雄性Wistar大鼠80只 [中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK（滬）2007.0005]，按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)部，自由攝食飲水，動(dòng)物房溫度21～23℃，相對(duì)濕度 40%～60%。

1.2 骨骼肌鈍挫傷模型建立

大鼠麻醉后（戊巴比妥鈉，50 mg/kg體重，腹腔注射），參照Kami等[6]的大鼠骨骼肌急性鈍挫傷模型制作方法，將大鼠右側(cè)后肢置于伸膝、踝背屈90°位置上，用重約335 g的重物自80 cm高處落下，落至V形塑料制圓錐體打擊器上，打擊大鼠后肢小腿腓腸肌中段內(nèi)側(cè)面（距跟骨約1.15 cm處，打擊動(dòng)能為2.646 J，打擊面積約0.65 cm2）。受傷局部皮膚完好，解剖證實(shí)骨骼肌鈍挫傷造模成功率達(dá)100%。

1.3 動(dòng)物分組

80只大鼠隨機(jī)分成A組 （黃芪皂甙組）、B組（丹參酮ⅡA組）、C組（丹參酮ⅡA+黃芪皂甙組）、D組（黃芪丹參注射液組）、E組（生理鹽水對(duì)照組）。大鼠骨骼肌損傷后即刻，按不同分組，分別于損傷部位皮下（肌膜外）注射黃芪皂甙（A 組）（5 mg/ml）、丹參酮ⅡA（B 組）（5 mg/ml）、黃芪皂甙丹參酮ⅡA 等體積混合液（C組）、黃芪丹參等體積混合液（D組）及生理鹽水（E組），注射量均為1 ml/只/次。以后每隔3天注射1次，直到損傷后第27天。

1.4 處死取材

于右下肢鈍挫打擊傷后第4天、7天、14天和28天，分別從各組中隨機(jī)取4只大鼠，脫頸處死后進(jìn)行右下肢腓腸肌損傷部位取材。完整取出右下肢腓腸肌后，立即將標(biāo)本儲(chǔ)存于液氮中待用。

1.5 Western Blot檢測

運(yùn)用Western Blotting法檢測MHC-emb和vimentin蛋白表達(dá)水平:①組織蛋白的抽提:切取約100 mg組織樣品，每樣本加入1 ml的T-PER試劑，電動(dòng)勻漿器進(jìn)行組織勻漿，離心5分鐘后收集上清液；②使用BCA法進(jìn)行總蛋白定量:分別吸取0.1 ml的標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品至各自管中，每管加入2 ml WR，并混勻，37℃30 min孵育，光度計(jì)檢測各管吸收，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各未知樣品的蛋白濃度；③SDS－PAGE電泳:玻璃板上制膠后將樣品加入離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1倍。取10 μl蛋白樣品加入電泳，分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；④轉(zhuǎn)膜:將PVDF膜切成與凝膠尺寸大小一致，置于甲醇中浸透10秒鐘，立即轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液中平衡20分鐘；用三張濾紙貼于兩張多孔墊料，將PVDF膜、膠夾于中間。PVDF膜朝正極，400 mA轉(zhuǎn)膜120 min后用立春紅染色；⑤雜交:PVDF膜常溫封閉2小時(shí)并沖洗后，加入一抗，分別為 MHC-emb （mouse anti-rat，1∶1000 稀釋，Ab-cam 公司，美國）；vimentin（rabbit anti-rat，1∶1000 稀釋，Abcam公司，美國），4℃過夜；TBST洗膜3次后，加入二抗，分別為 MHC-emb（anti-mouse，1∶5000 稀釋，Cell Signaling 公司，美國），vimentin（anti-rabbit，1∶3000 稀釋，Cell Signaling 公司，美國），室溫反應(yīng) 1小時(shí)后TBST洗膜3次。⑥檢測:采用化學(xué)發(fā)光試劑（PierceRECL Western Blotting Substrate，Thermo 公司，美國）進(jìn)行檢測。采用復(fù)日FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司，中國）攝像分析，以目的蛋白條帶的相對(duì)吸光度值 （與GAPDH吸光度值的比值）作為目的蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用TWO-WAY ANOVA方法進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥黃芪皂甙與丹參酮ⅡA對(duì)大鼠急性鈍挫傷后MHC-emb蛋白表達(dá)的影響

骨骼肌急性鈍挫傷后，MHC-emb蛋白表達(dá)即開始升高，傷后14天達(dá)到峰值，之后逐漸下降，一直持續(xù)到傷后28天；與生理鹽水組相比，各干預(yù)組MHC-emb表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這種情況一直持續(xù)到傷后28天；其中又以C組和D組升高最為明顯，且C組和D組的高峰在傷后 21天才出現(xiàn)（圖 1，表1）。

2.2 中藥黃芪皂甙與丹參酮ⅡA對(duì)大鼠急性鈍挫傷后vimentin蛋白表達(dá)的影響

骨骼肌急性鈍挫傷后，vimentin蛋白表達(dá)即開始升高，傷后14天升高最為明顯，一直持續(xù)到傷后28天，仍然維持在一個(gè)較高的水平；與生理鹽水組相比，干預(yù)組vimentin表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這種情況一直持續(xù)到傷后28天；其中又以C組和D組降低最為明顯（圖2，表2）。

3 討論

3.1 活血化淤中藥在骨骼肌鈍挫傷后修復(fù)過程中的作用

黃芪、丹參是兩味傳統(tǒng)中藥，具有改善微循環(huán)、穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗纖維化、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等作用，被廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)黃芪丹參類活血化淤中藥能夠促進(jìn)骨骼肌損傷后的修復(fù)，不但能夠促進(jìn)肌肉再生指標(biāo)肌球蛋白重鏈（MCH）的表達(dá)增高并提前合成，而且還能降低纖維化指標(biāo) I、III型膠原合成[2]。生物力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黃芪丹參后3周，損傷骨骼肌的最大顫搐張力、斷裂強(qiáng)度及拉伸形變能力較自然愈合組明顯改善[4]。肌電圖評(píng)價(jià)也證實(shí)，此類中藥能夠明顯加速損傷骨骼肌愈合過程中異常肌電信號(hào)的消失，促進(jìn)肌電恢復(fù)，提高愈合質(zhì)量[3]。

表1 各干預(yù)組MHC-emb/GAPDH值（±s，n=4）

表1 各干預(yù)組MHC-emb/GAPDH值（±s，n=4）

*P<0.05:與生理鹽水組同一時(shí)間點(diǎn)相比較，#P<0.05:與黃芪丹參組同一時(shí)間點(diǎn)相比較。

A?????B????IIA C????????IIA D?????E?????Day 4 0.15–0.04 0.17–0.06 0.31–0.18 0.30–0.08 0.08–0.09 Day 7 0.39–0.09 0.41–0.17 0.48–0.12 0.48–0.09 0.27–0.08 Day 14 0.37–0.05 0.41–0.10 0.54–0.17 0.57–0.11> 0.31–0.06 Day 28 0.27–0.07 0.31–0.04 0.49–0.10 0.53–0.06 0.14–0.05

表2 各干預(yù)組Vimentin/GAPDH值（±s，n=4）

表2 各干預(yù)組Vimentin/GAPDH值（±s，n=4）

*P<0.05:與生理鹽水組同一時(shí)間點(diǎn)相比較，#P<0.05:與黃芪丹參組同一時(shí)間點(diǎn)相比較。

E?????Day 4 0.27–0.03*# 0.28–0.04*# 0.18–0.04* 0.14–0.03* 0.35–0.07 Day 7 0.40–0.05*# 0.38–0.05*# 0.26–0.03* 0.28–0.06* 0.45–0.06 Day 14 0.55–0.14*# 0.54–0.11*# 0.42–0.05* 0.40–0.08* 0.65–0.13 Day 28 0.47–0.09*# 0.45–0.04*# 0.35–0.08* 0.31–0.04* 0.54–0.05 A?????B????IIA C????????IIA D?????

雖然已經(jīng)證實(shí)中藥黃芪丹參復(fù)方注射液可以促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)，但是這些中藥復(fù)合物成分較為復(fù)雜，在促進(jìn)骨骼肌損傷愈合過程中何種藥物發(fā)揮作用具體仍不清楚。這將影響中藥在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的合理性，限制其在更廣層面的推廣和應(yīng)用。隨著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，目前針對(duì)中成藥中的部分組成部分的研究正在逐步開展。黃芪皂甙、丹參酮ⅡA分別是黃芪和丹參的主要有效成分，在某些研究領(lǐng)域其作用效果與各自復(fù)合物相差無幾[7-10]，甚至在心腦血管臨床應(yīng)用上已經(jīng)開始逐漸替代其復(fù)合物。因此本研究選用黃芪皂甙、丹參酮ⅡA兩種單體作為主要研究對(duì)象，進(jìn)一步探討活血化淤中藥對(duì)大鼠骨骼肌鈍挫傷后vimentin和MHC-emb表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究它們治療骨骼肌損傷的效果。在前期研究工作中，我們已經(jīng)證實(shí):在急性骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中，黃芪皂甙、丹參酮IIA能促進(jìn)MHC-emb mRNA表達(dá)，抑制波形蛋白mRNA表達(dá)，與黃芪丹參混合使用效果與黃芪丹參基本一致。但這只是基因轉(zhuǎn)錄層面的觀察結(jié)果，組織器官中的功能執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，從mRNA到功能蛋白還需要經(jīng)過翻譯的過程，mRNA的升高并不代表功能蛋白的表達(dá)一定會(huì)升高。因此，還需了解在肌肉損傷修復(fù)過程中MHC、波形蛋白的蛋白表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步評(píng)價(jià)黃芪皂甙、丹參酮ⅡA在骨骼肌損傷后修復(fù)過程中的作用[5]。本研究的內(nèi)容即是從蛋白水平了解黃芪皂甙、丹參酮ⅡA在骨骼肌損傷修復(fù)中對(duì)emb-MHC和波形蛋白的影響。研究結(jié)果也證實(shí)，黃芪皂甙、丹參酮IIA能促進(jìn)MHC-emb表達(dá)，抑制波形蛋白表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用效果更佳，作用近似于復(fù)方成分，與mRNA表達(dá)的變化趨勢基本一致。

3.2 胚胎型肌球蛋白重鏈與波形蛋白在骨骼肌急性鈍挫傷傷后表達(dá)的意義

骨骼肌損傷的愈合包括急性反應(yīng)期、修復(fù)期和重塑型期三個(gè)時(shí)期[11，12]。骨骼肌的修復(fù)開始于傷后7－10天，傷后2周達(dá)到高峰，3－4周開始下降。骨骼肌的再生有賴于成肌細(xì)胞的活化，它們可以通過增殖、增生、分化、融合，最后形成新肌管，最終形成肌纖維。骨骼肌損傷修復(fù)過程中肌球蛋白重鏈的表達(dá)會(huì)明顯升高。與骨骼肌發(fā)育過程相似，肌球蛋白重鏈也按胚胎型、新生型及成年型的順序表達(dá)[13]。MHC-emb在骨骼肌再生的過程中最早表達(dá)，更能精確地代表新生骨骼肌的數(shù)量。因此，本研究選擇檢測MHC-emb在骨骼肌損傷后的表達(dá)，以期更為精確地了解骨骼肌的再生情況。在本研究中發(fā)現(xiàn)，MHC-emb一般在傷后14天時(shí)達(dá)到高峰，之后慢慢下降，這與以往的研究相符。而且我們也發(fā)現(xiàn)，黃芪皂甙與丹參酮ⅡA聯(lián)合應(yīng)用后，不僅可提高M(jìn)HC-emb的表達(dá)，而且表達(dá)的高峰一直延遲到傷后3周才出現(xiàn)，表明這兩種中藥聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)延長新生骨骼肌的再生時(shí)間，從而進(jìn)一步促進(jìn)骨骼肌損傷愈合。

vimentin（波形蛋白）是中間纖維家族蛋白的一員，它與微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架。盡管大多數(shù)中間纖維是相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但在成纖維細(xì)胞中波形蛋白以一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)存在。vimentin作為間質(zhì)組織纖維化的主要標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于檢測骨骼肌損傷修復(fù)過程中的纖維化[14-16]。通常在骨骼肌損傷后vimentin表達(dá)越高，表明纖維化情況越重，越不利于骨骼肌的修復(fù)。因?yàn)檫^多的纖維化組織會(huì)形成大量的疤痕，疤痕形成的機(jī)械屏障會(huì)抑制整個(gè)損傷區(qū)域骨骼肌的完全再生[17]，因此，有必要抑制骨骼肌損傷后纖維化的表達(dá)來促進(jìn)骨骼肌損傷愈合的質(zhì)量。骨骼肌損傷后纖維化的發(fā)生要稍晚于修復(fù)啟動(dòng)，一般在傷后10～14天開始，傷后18到21天時(shí)達(dá)到高峰[15]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到，各實(shí)驗(yàn)組vimentin的表達(dá)高峰一般在傷后3周出現(xiàn)，這與以往的研究結(jié)果也相符。黃芪皂甙與丹參酮IIA聯(lián)合具有良好的抑制vimentin表達(dá)的作用，其抑制能力與中藥復(fù)方成分基本一致。

目前已證實(shí)，黃芪丹參注射液在骨骼肌損傷修復(fù)過程中能夠改善局部微循環(huán)，促進(jìn)損傷局部的修復(fù)。而黃芪皂甙與丹參酮IIA在骨骼肌急性鈍挫傷后能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕骨骼肌損傷[18，19]。 當(dāng)然，黃芪皂甙、丹參酮IIA是如何促進(jìn)MHC-emb表達(dá)，抑制波形蛋白的表達(dá)，尚需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)

在急性骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中，黃芪皂甙、丹參酮IIA均能促進(jìn)MHC-emb表達(dá)，抑制波形蛋白表達(dá)，聯(lián)合使用時(shí)效果與黃芪丹參復(fù)方成分基本一致。

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