段玉雙卜淑敏楊少鋒王國(guó)嬌

1濰坊醫(yī)學(xué)院（山東濰坊261053） 2首都體育學(xué)院

絕經(jīng)女性由于卵巢功能衰退易發(fā)生肥胖，肥胖導(dǎo)致脂代謝紊亂，而肝臟是脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所之一。研究表明，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）在脂肪酸氧化及脂質(zhì)代謝中起重要作用，是脂類代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子[1]。相關(guān)研究表明，大鼠經(jīng)過16周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，訓(xùn)練組所有組織PPAR-γ表達(dá)均升高[2]。單獨(dú)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢大鼠肝臟GSK-3β和PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響鮮見報(bào)道。我們的前期研究表明，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著抑制去卵巢大鼠體重和腹腔內(nèi)脂肪重量增加[3]，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察了中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢大鼠肝臟在Ser9位點(diǎn)磷酸化的GSK-3β（PGSK-3β）和PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響，為探討運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢大鼠肝脂代謝影響的機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康3月齡雌性SD大鼠80只，體重（230±10）g。購(gòu)自并飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK （京）2006-0008，使用許可證號(hào)為:SYXK（京）2006-0025]。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，按體重分層后隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，20只）和去卵巢手術(shù)組（OVX，60只）。手術(shù)前，兩組大鼠均禁食12～18h，腹腔注射水合氯醛（0.3 ml/100g）麻醉，去卵巢手術(shù)組均從背部切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組不切除卵巢，只將卵巢旁與卵巢等大的脂肪組織切除。術(shù)后恢復(fù)1周，按體重分層后將去卵巢手術(shù)組大鼠又隨機(jī)分為去卵巢靜止 （OVX）、去卵巢運(yùn)動(dòng)（EX）和雌激素（E2）3 個(gè)組，每組 20 只。

1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和17β-雌二醇注射方案

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和17β-雌二醇配制及注射方案均參考我們前期研究報(bào)道[4]并適當(dāng)調(diào)整。手術(shù)后第2周，去卵巢運(yùn)動(dòng)組大鼠在小動(dòng)物跑臺(tái)上開始適應(yīng)訓(xùn)練1周，跑速?gòu)牡?天的15 min、0坡度逐漸增加到第5天的45 min、坡度5°。正式運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案為跑速18 m/min、時(shí)間45 min、坡度5°，每周 5次。 從手術(shù)后第2周開始，每周一、三、五上午9點(diǎn)，雌激素組頸部皮下注射3次17β-雌二醇，注射劑量為25 μg/kg體重。所有處理均在上午進(jìn)行。每周稱體重1次，根據(jù)體重調(diào)整17β-雌二醇的注射劑量。假手術(shù)組和去卵巢靜止組每天只在籠中自由活動(dòng)。

1.3 樣品采集和處理

分別于去卵巢后7周和14周時(shí)各處死一半動(dòng)物。取材前大鼠均禁食12～14h，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，迅速將同一部位的一塊肝臟切成小塊分裝入Eppendof離心管后，-80℃冷凍保存以提取蛋白。

1.4 主要試劑和儀器

17β-雌二醇:Sigma公司；水合氯醛注射液:由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供；PPAR-γ抗體（SC-7273）和 β-actin 抗體（sc-1616R）:美國(guó) Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG或馬抗小鼠IgG/堿磷酶標(biāo)記抗體:中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝；BCIP/NBT顯色濃縮液:中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝；RIPA蛋白裂解液（P0013B）:碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（P0015）:碧云天生物技術(shù)有限公司；DSPT-202小動(dòng)物跑臺(tái):杭州段氏制造廠；DYY-7C型電泳儀:北京六一儀器廠。

1.5 Western blotting 測(cè)定 GSK-3β、P-GSK-3β 和PPAR-γ蛋白表達(dá)

取200 mg肝臟在液氮中研磨成粉末，加入1 ml組織裂解液，4℃、12000 r/min 離心 30 min，取上清，留一部分檢測(cè)蛋白濃度，其余蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（按照 4∶1）混勻，沸水煮 5 min，分裝后-40℃保存。取蛋白樣品40 μg上樣，以80V電壓，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離約2 h后，以80V電壓轉(zhuǎn)移2 h。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，將PVDF膜與按說明書稀釋的GSK-3β（1∶800）、P-GSK-3β（1∶800）、PPAR-γ（1∶600）或 β-actin（1∶600）一抗 4℃過夜，次日 TBST 洗 3×10 min，分別加山羊抗兔 IgG/堿磷酶標(biāo)記（1∶800）或馬抗小鼠 IgG/堿磷酶標(biāo)記（1∶800）二抗室溫孵育 2 h，TBST 洗 3×10 min，在BCIP/NBT顯色液中顯色至條帶出現(xiàn)，放入水中終止顯色，拍照，掃描各條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用One-Way ANOVA，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肝臟P-GSK-3β/GSK-3β比值

手術(shù)后第7和14周時(shí)，去卵巢靜止組大鼠肝臟P-GSK-3β/GSK-3β比值顯著低于假手術(shù)組 （P<0.01），去卵巢運(yùn)動(dòng)組和雌激素組肝臟P-GSK-3β/GSK-3β比值均顯著高于去卵巢靜止組（P<0.01），結(jié)果分別見圖1和圖2。

2.2 肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)

手術(shù)后第7和14周時(shí)，去卵巢靜止組大鼠肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組（7周時(shí)P<0.05，14周時(shí)P<0.01），而去卵巢運(yùn)動(dòng)組和雌激素組肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)量均顯著高于去卵巢靜止組（P <0.01），結(jié)果見圖 3和圖 4。

3 討論

脂代謝紊亂是婦女絕經(jīng)后面臨的機(jī)體異常之一，是內(nèi)源性雌激素水平下降所致[5]。肝臟是脂類代謝的重要場(chǎng)所，能夠分泌多種酶類，參與調(diào)節(jié)脂類的消化、吸收、運(yùn)輸、分解代謝和合成代謝等，而GSK-3β和PPAR-γ是其中的調(diào)控因子之一。

國(guó)內(nèi)外模擬臨床絕經(jīng)導(dǎo)致脂代謝紊亂常采用去卵巢大鼠模型[6]。我們前期研究表明，去卵巢7周和14周，與假手術(shù)組相比，去卵巢靜止組體脂含量、肝臟TC、TG顯著升高，而肝臟重量和指數(shù)未見顯著變化[4]，表明去卵巢大鼠在肝臟重量和指數(shù)未見明顯改變的情況下，腹腔內(nèi)脂肪積累，肝臟已發(fā)生脂代謝紊亂。

GSK-3β是一種多功能蛋白激酶。以往研究表明[7]，GSK-3β 在 N 端 Ser9 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化后，活性降低。本研究以P-GSK-3βSer9相對(duì)于總GSK-3β的比值作為判斷其活性的依據(jù)。GSK-3β可抑制糖原合成及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)糖異生，抑制胰島素的分泌并阻礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮升高血糖的作用。運(yùn)動(dòng)對(duì)GSK-3β蛋白表達(dá)的影響研究比較晚，且大部分集中在運(yùn)動(dòng)通過GSK-3β調(diào)節(jié)和改善胰島素抵抗方面。Bishop等[8]研究證實(shí):糖尿病鼠肝臟GSK-3β mRNA是對(duì)照組的143%，且糖尿病鼠肝臟GSK-3β半衰期延長(zhǎng)為8 h，而對(duì)照組為5 h。在培養(yǎng)的糖尿病肝細(xì)胞的介質(zhì)中，補(bǔ)充胰島素可以降低GSK-3β mRNA到接近正常水平。陳丹等[9]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):大鼠運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后骨骼肌GSK-3β含量較胰島素抵抗組減少27.24%，即運(yùn)動(dòng)能降低胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)水平。但目前運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢大鼠肝臟GSK-3β蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，去卵巢靜止組P-GSK-3β/GSK-3β顯著降低，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)7周和14周后，此比值顯著升高，說明運(yùn)動(dòng)有效抑制去卵巢大鼠肝臟GSK-3β蛋白表達(dá)和/或增加GSK-3β在N端Ser9位點(diǎn)磷酸化水平而降低其生理學(xué)效應(yīng)，從而減輕GSK-3β對(duì)其下游靶對(duì)象的負(fù)性調(diào)節(jié)，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

PPAR-γ是一種核轉(zhuǎn)錄受體，屬于PPAR家族（PPARs）。PPAR-γ除了在脂肪細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用外，還在介導(dǎo)脂肪酸氧化及脂質(zhì)代謝中起重要作用[10]，是脂類代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。運(yùn)動(dòng)與PPAR-γ關(guān)系的研究大部分集中在運(yùn)動(dòng)通過PPAR-γ來調(diào)節(jié)胰島素抵抗、脂肪分化和抗炎癥等方面。陳玉娟等[11]研究發(fā)現(xiàn):8周耐力游泳運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)大鼠脂肪組織PPAR-γ蛋白表達(dá)量增加。馮彥景[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)12周游泳訓(xùn)練可使胰島素抵抗小鼠肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)水平顯著升高。在去卵巢模型中，肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)情況及運(yùn)動(dòng)對(duì)其影響鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，去卵巢手術(shù)后第7周和14周時(shí)，大鼠肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)量均降低，而中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和雌激素干預(yù)7周和14周均能使去卵巢大鼠肝臟PPAR-γ蛋白含量顯著增加。說明運(yùn)動(dòng)和雌激素均能有效而穩(wěn)定地上調(diào)肝臟PPAR-γ蛋白表達(dá)。運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體發(fā)生很多變化，包括激素反應(yīng)、能量代謝和酸堿平衡等，這些可能影響PPARs家族基因在肝臟組織中的表達(dá)，而PPAR-γ能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)載脂蛋白、脂肪酸氧化酶系與脂蛋白脂酶等，從而促進(jìn)脂質(zhì)的氧化代謝，降低血脂濃度；介導(dǎo)載脂蛋白apoA-1表達(dá)；促進(jìn)脂蛋白脂肪酶合成，使乳糜微粒和極低密度脂蛋白合成減少，促進(jìn)脂質(zhì)代謝平衡，從而起到改善機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂的作用。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)上調(diào)去卵巢大鼠肝臟P-GSK-3β/GSK-3β比值及PPAR-γ蛋白表達(dá)，且效果穩(wěn)定。

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