宋貴軍，林璐璐，李 昱，曹云鵬

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116027;2.中國醫(yī)科大學 附屬一院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要特征為進行性認知功能障礙［1］。新生神經(jīng)元未能替代病變神經(jīng)元是影響AD預后的關鍵因素。海馬在AD患者病程發(fā)展中具有重要作用，而該部位的神經(jīng)元再生情況是治療AD患者的重要靶點［2-3］。芥子堿(sinapine，3.5-二甲基，4-羥基苯丙烯酰膽堿)是廣泛存在于十字花科植物中的酚類小分子生物堿，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射等多種生物學功效［4］。研究表明，芥子堿可改善AD大鼠的學習和記憶障礙，并可改善海馬膽堿功能缺失，提示芥子堿是可用于AD的治療［5］。但目前對芥子堿能否促進AD的海馬神經(jīng)元再生及改善相關指標水平尚不清楚，因此本研究給予Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠芥子堿處理，觀察對海馬神經(jīng)元再生及相關指標的影響，為AD的治療提供依據(jù)。

1 材料

芥子堿(純度＞93%)，上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Aβ25-35、二甲亞砜(DMSO)、TritonX100，美國Sigma公司;β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標記鼠二抗、兔二抗單克隆抗體，美國Santa Cruz公司;海馬生長相關蛋白43(GAP-43)和突觸素(P38)多克隆抗體，美國Cell Sigaling Technology公司;BCA蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司;TUNEL顯色試劑盒，Roche公司;丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒，南京建成生物工程研究所。

健康雄性ICR小鼠，體重25～30 g，購于北京維通利華公司，合格證號:SCXK(京)2011-0034。

2 方法

2.1 Aβ25-35小鼠模型制備

采用側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35誘導認知功能障礙小鼠模型:將Aβ25-35肽段溶于水中，終濃度為3 mmol/L，封口膜封口后于37℃水浴中孵育96 h。腹腔注射2%水合氯醛溶液(10～20mL/kg)麻醉小鼠，將其固定于腦立體定位儀上。行顱頂正中切開，暴露顱骨，以前囟點為坐標，前囟點后0.3 mm，右側(cè)1 mm，深2.5 mm為側(cè)腦室注射坐標，緩慢注射Aβ25-35溶液5 nmol(1.7μL)，留針3 min，保證溶液充分進入側(cè)腦室。而假手術組則注射生理鹽水1.7μL，其余操作步驟與Aβ25-35組一致。術畢縫合皮膚。

2.2 分組及給藥

將小鼠分為4組:假手術組、Aβ25-35組、假手術+芥子堿組和Aβ25-35+芥子堿組，每組各10只。Aβ25-35組和Aβ25-35+芥子堿組為采用側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠，其余兩組為正常小鼠;假手術+芥子堿組和Aβ25-35+芥子堿組于術后灌胃給予芥子堿30mg/kg，1次/d，連續(xù)3周，其余兩組給予等體積的水。

2.3 學習記憶功能檢測

采用Y型電迷宮法檢測學習和記憶功能。小鼠在電壓(70 mV)電擊足部，向三等分輻射式反射箱逃避，反射箱的三個手臂頂端均有信號燈，且燈亮時則示意此臂安全無電。造模后1周將小鼠放入Y型電迷宮內(nèi)讓其適應環(huán)境，當小鼠由電擊區(qū)域逃至不通電區(qū)域時為正確反應。記錄每組的學習成績(連續(xù)10次中有9次正確反應所需要的電擊次數(shù))和記憶成績(連續(xù)10次測試中的正確反應次數(shù))。

2.4 細胞凋亡指數(shù)

過量麻醉法處死小鼠，迅速斷頭取腦，采用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈，置于液氮中至適當硬度;取出固定后的鼠腦，選擇海馬CA1區(qū)，用冰凍切片機進行冠狀連續(xù)切片，腦片厚度為40μm，每隔200μm取1張，每只小鼠取12張腦片。采用TUNEL試劑盒進行腦片染色，采用顯微鏡觀察形態(tài)，于每組隨機選取5個高倍鏡視野，分別計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，并計算凋亡指數(shù)。

2.5 ELISA法檢測海馬 MDA、TNF-α 水平和SOD活性

取海馬組織，于冰上研磨并裂解15 min;12 000 r/min離心20 min，收集上清，并分別采用MDA、TNF-α和SOD試劑盒來檢測相應指標，操作步驟依據(jù)試劑盒說明書。

2.6 Western blot實驗

取海馬組織，加入全蛋白提取緩沖液0.5mL于冰上裂解15 min;12 000 r/min離心20 min后，取上清并采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與加樣緩沖液混合，取等量蛋白加樣并行10%SDSPAGE凝膠電泳。電泳條件:濃縮膠恒壓80 V約20 min，分離膠100 V約80 min。半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，按約0.1mL/cm2的量加適量一抗，GAP-43和P38Akt的稀釋比例為分別為1∶200和1∶400。4℃孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜，加入二抗(稀釋比例1∶3 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用TBST充分洗膜。采用ECL法來顯色處理，膠片曝光后觀察蛋白的條帶，并采用Gel-Pro analyzer分析各顯影條帶的光密度，蛋白相對表達量為與β-actin的比值。

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 芥子堿對Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠學習記憶功能的影響

Aβ25-35組的學習次數(shù)多于假手術組，記憶次數(shù)少于假手術組(P＜0.05)，而芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導引起的學習次數(shù)增多和記憶次數(shù)減少(P＜0.05)，但仍與假手術組有差異(P＜0.05);芥子堿處理對假手術組的學習記憶功能無影響，見表1。

表1 4組小鼠的學習和記憶情況

3.2 芥子堿對Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

Aβ25-35組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率為(39.48±5.78)%，高于假手術組的(0.95±0.32)%(P＜0.05);而Aβ25-35+ 芥子堿組為(22.83±6.57)%，可見，芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導引起的CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率升高，但仍與假手術組有差異(P＜0.05);假手術 + 芥子堿組為(0.87±0.41)%，可見，芥子堿處理對假手術組的CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率無影響。TUNEL染色圖見圖1。

圖1 芥子堿對對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

3.3 芥子堿對Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠海馬MDA、SOD和TNF-α的影響

Aβ25-35組的MDA和TNF-α水平高于假手術組，SOD活性低于假手術組(P＜0.05)，而芥子堿處理可改善 Aβ25-35誘導引起的MDA和TNF-α水平升高，SOD活性降低，但仍與假手術組有差異(P＜0.05);芥子堿處理對假手術組的海馬MDA、SOD和TNF-α水平無影響，見表2。

3.4 芥子堿對Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠海馬GAP-43和P38的影響

Aβ25-35組的GAP-43和P38蛋白水平均低于假手術組(P＜0.05)，而芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導引起的GAP-43和P38蛋白水平降低，但仍與假手術組有差異(P＜0.05);芥子堿處理對假手術組的海馬GAP-43和P38蛋白水平無影響，見表3。Western blot結果見圖2。

表2 4組小鼠海馬的MDA、SOD和TNF-α水平比較

表3 4組小鼠海馬的GAP-43和P38水平比較(相對光密度)

圖2 芥子堿對海馬GAP-43和P38蛋白的影響

4 討論

芥子堿是廣泛存在于十字花科植物中的一種酚類小分子生物堿，具有多種生物功能，如抗氧化、抗輻射、抗炎、抗衰老等［4］。近期研究表明，芥子堿可改善癡呆大鼠的乙酰膽堿功能缺失，并改善學習功能障礙［5］，提示其在治療AD中具有較好的應用前景。

本研究結果表明，Aβ25-35處理可導致小鼠的學習和記憶功能障礙，主要與側(cè)腦室注射Aβ25-35可引起神經(jīng)系統(tǒng)退化有關，如突觸丟失、神經(jīng)元變性、學習記憶能力受損［6］。而芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導引起的學習記憶障礙，但仍與假手術組有差異，表明芥子堿可改善Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠的學習和記憶損傷。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Aβ25-35處理的海馬神經(jīng)元凋亡增多，表明Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠的神經(jīng)再生受到抑制，也是Aβ25-35處理的小鼠出現(xiàn)學習和記憶功能障礙的主要原因。芥子堿可降低Aβ25-35誘導的海馬神經(jīng)元細胞凋亡率增加，提示其對改善Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生有一定的促進作用。

氧化應激導致的自由基損傷可影響AD的治療效果，而MDA、TNF-α水平和SOD活性是評價氧化應激的常用指標。GAP-43是神經(jīng)元生長發(fā)育和神經(jīng)可塑性的首選分子探針［7］，P38是評價海馬神經(jīng)元突觸發(fā)育過程中的常用指標［8］。因此，采用以上指標來評價芥子堿處理對海馬分子指標的影響，發(fā)現(xiàn)芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠海馬區(qū)以上指標的異常，表明其可改善海馬氧化應激水平，并促進神經(jīng)的再生。以上指標的變化提示降低氧化應激水平、促進突觸發(fā)育和神經(jīng)可塑是芥子堿發(fā)揮認知障礙保護作用的可能機制。

綜上所述，芥子堿可改善Aβ25-35誘導的認知功能障礙小鼠的學習記憶功能障礙，降低海馬神經(jīng)元凋亡，并緩解海馬區(qū)與神經(jīng)再生相關蛋白及分子的水平。

［1］周竹青，易 黎，韓金玲，等.納米技術在阿爾茨海默病基因診斷的研究進展［J］.中國老年學雜志，2011，31(21):4282-4284.

［2］Verret L，Jankowsky JL，Xu G M，etal.Alzheimer's-type amyloidosis in transgenic mice impairs survival of newborn neurons derived from adult hippocampal neurogenesis［J］.J Neurosci，2007，27:6771-6780.

［3］Christie B R，Cameron H A.Neurogenesis in the adult hippocampus［J］.Hippocampus，2006，16:199-207.

［4］柯木根，吳國欣，林燕妮，等.芥子堿的研究概況［J］.中草藥，2007，38(9):1436-1439.

［5］閆秋麗，化 偉，羅麗丹，等.芥子堿對癡呆大鼠學習記憶障礙及海馬膽堿能功能的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23(5):1188-1189.

［6］Li X，Zuo P P.Effects of Aβ25-35on neurogenesis in the adult mouse subventricular zone and dentate gyrus［J］.Neurol Res，2005，27:218-322.

［7］吳 飛，喻愛喜，邢丹謀，等.重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對鼠雪旺細胞增殖及生長相關蛋白GAP-43表達的影響［J］.中華實驗外科雜志，2011，28(9):1553-1555.

［8］李秋霞，陳淅泠，王欣東，等.丁苯酞注射液對血管性癡呆大鼠海馬區(qū)生長相關蛋白-43及突觸素P38表達的影響［J］.實用醫(yī)學雜志，2012，28(7):1067-1069.