王智鼎，宋 艷，孫 麗，孫德軍

(1.吉林大學(xué) 藥學(xué)院 再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春遠(yuǎn)大國(guó)奧制藥有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012)

亞甲基藍(lán)對(duì)豬凝血酶病毒滅活/去除工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

王智鼎1，宋 艷1，孫 麗2，孫德軍1

(1.吉林大學(xué) 藥學(xué)院 再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春遠(yuǎn)大國(guó)奧制藥有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012)

目的 驗(yàn)證亞甲基藍(lán)光化學(xué)法滅活豬凝血酶中病毒的滅活效果，完善生產(chǎn)工藝。方法 在SINV、EMCV、PPV和PRV等4種病毒中，加入0.5 mg/L的亞甲基藍(lán)置于病毒光照滅活儀上光照2 h和用60 kD膜超濾的滅活病毒方法來(lái)驗(yàn)證工藝的可行性。結(jié)果 經(jīng)亞甲基藍(lán)可有效滅活病毒，經(jīng)超濾法濾除可有效去除病毒。摻入到凝血酶原液中的病毒以及在原培養(yǎng)物中病毒都喪失了對(duì)細(xì)胞的感染性，降低的滴度TCID50高于4 Log10。結(jié)論 亞甲基藍(lán)光化學(xué)法可有效滅活豬凝血酶中病毒。

凝血酶;亞甲基藍(lán);病毒

凝血酶(Thrombin)是從豬血中提出的促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，應(yīng)用于創(chuàng)口，使血液凝固而止血的藥品［1］。但豬的血液制品中會(huì)帶有一些人畜共患病毒原體［2-3］，對(duì)藥品的質(zhì)量和人的健康產(chǎn)生重大的威脅。亞甲基藍(lán)因其與細(xì)胞膜上的磷脂、蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合，經(jīng)過(guò)一定波長(zhǎng)的光照后，產(chǎn)生活性氧原子，破壞病毒脂包膜，從而滅活病毒［3-5］。亞甲基藍(lán)是一種治療高鐵血紅蛋白血癥的藥品，人每天1～2 mg/kg長(zhǎng)期注射沒(méi)有明顯的副作用［6］，其光化學(xué)法滅活血液成分中病毒的技術(shù)在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)展多年，在國(guó)外已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于臨床［7］。所以我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)上［8-9］，結(jié)合動(dòng)物源性生物制品的特殊要求，選擇了SINV(辛德畢斯病毒)、EMCV(腦心肌炎病毒)、PPV(豬細(xì)小病毒)和PRV(偽狂犬病病毒)等4種病毒代表了DNA、RNA、有囊膜和無(wú)囊膜病毒及過(guò)濾指示病毒，具有較好的代表性，確定作為本試驗(yàn)的指示病毒，用亞甲基藍(lán)0.5 mg/L置于病毒光照滅活儀上光照2 h和用60 kD膜超濾的滅活病毒方法來(lái)驗(yàn)證工藝的可行性。

1 材料

凝血酶原液(批號(hào)為100901、100902、100903)，長(zhǎng)春遠(yuǎn)大國(guó)奧藥業(yè)有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素(雙抗)、胰酶，Gibco公司;60 kD超濾管，長(zhǎng)春Hyclone科技有限公司。

SINV、EMCV、PPV、PRV、傳代細(xì)胞系 PK-15(豬腎細(xì)胞)、Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法

2.1 病毒制備

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行［10］，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用DMEM培養(yǎng)液加10%胎牛血清作為細(xì)胞的培養(yǎng)液(pH 7.2)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，在細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰酶消化細(xì)胞。在PK-15細(xì)胞傳代時(shí)同步接種PRV和PPV;在Vero細(xì)胞生長(zhǎng)為單層時(shí)接種EMCV和 SINV。接種量為 0.5 mL/瓶(50 mL培養(yǎng)瓶)，連續(xù)培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)后于－20℃和37℃反復(fù)凍融3次，收集病毒液。以未接種病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)的測(cè)定

按常規(guī)方法［11］，將傳代消化后的細(xì)胞稀釋成約105～106個(gè)/mL后，轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，用0.18 mL/孔;待Vero細(xì)胞隔夜長(zhǎng)成單層后接種EMCV和SINV、PK-15細(xì)胞傳代時(shí)同步接種PRV和PPV，接毒時(shí)將病毒液作連續(xù)的10倍稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度分別接種8孔，0.1 mL/孔，并用生理鹽水作陰性對(duì)照，置37℃，5%CO2培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞病變并記錄，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2.3 模擬工藝樣品的制備

2.3.1 亞甲基藍(lán)病毒滅活實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取原液，在超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)，每支2 mL凍存管中加入原液1.8 mL;每管再加入指示病毒各0.2 mL(樣品中最終病毒滴度大于6.5Log10)，作為亞甲基藍(lán)試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組。再在其中加入亞甲基藍(lán)至0.5 mg/L，作為亞甲基藍(lán)組。按生產(chǎn)工藝中的病毒滅活/去除工藝樣品進(jìn)行處理，將摻入病毒標(biāo)記為亞甲基藍(lán)組對(duì)照的凍存管，放入病毒滅活光照培養(yǎng)箱，照射2 h，作為下一步病毒滅活效果檢測(cè)的樣品。

2.3.2 超濾病毒濾除實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取原液，在超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)，每支2 mL凍存管中加入原液1.8 mL;每管再加入指示病毒各0.2 mL(樣品中最終病毒滴度大于6.5Log10)，用60 kD超濾管進(jìn)行超濾，作為超濾法滅活效果檢測(cè)的樣品，標(biāo)記為超濾。同時(shí)做不摻入病毒的樣品對(duì)照、培養(yǎng)基替代原液加入病毒的對(duì)照。

2.4 病毒滅活滴度測(cè)定

按2.1項(xiàng)下方法將傳代消化后的細(xì)胞稀釋成約105～106個(gè)/mL后細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞板，血清濃度為2%，Vero細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后傾去培養(yǎng)基，重新加入培養(yǎng)基0.09 mL后接毒;PK-15細(xì)胞按0.09 mL/孔傳代至培養(yǎng)板同步接毒。

3 結(jié)果

3.1 兩種病毒原液的制備與滴度測(cè)定

分別測(cè)定病毒的TCID50。通過(guò)倒置顯微鏡觀(guān)察，接種EMCV和SINV的Vero細(xì)胞接種24 h后出現(xiàn)折光性減弱，部分細(xì)胞圓縮、脫落、呈拉網(wǎng)狀，48 h后80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，培養(yǎng)液中懸浮大量的脫落壞死細(xì)胞;接種PRV和PPV 72 h后的PK-15細(xì)胞出現(xiàn)脫落、拉網(wǎng)等明顯的CPE。未接種病毒的Vero和PK-15保持貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)完整，未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。分別接種病毒48 h收集病變的Vero細(xì)胞、72 h收集 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)液，各收獲30 mL，分裝凍存管中，作為本試驗(yàn)的病毒原液。統(tǒng)計(jì)并按 Reed-Muench法計(jì)算 TCID50，測(cè)定 EMCV的TCID50為 6.71Log10/0.1 mL，PPV 的 TCID50為6.89 Log10/0.1 mL稀釋的病毒液，SINV的 TCID50為6.65Log10/0.1 mL 稀釋的病毒液，PRV 的 TCID50為7.2Log10/0.1 mL 稀釋的病毒液。

3.2 模擬工藝病毒滅活滴度測(cè)定

3.2.1 亞甲基藍(lán)滅活實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)亞甲基藍(lán)滅活后的樣品加入到培養(yǎng)液中觀(guān)察72 h后，對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)正常。與對(duì)照組相比SINV、EMCV和PRV病毒滴度降低4Log10以上，而對(duì)無(wú)包膜病毒PPV無(wú)明顯影響。

3.2.2 超濾濾除病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)超濾濾除后的樣品加入到培養(yǎng)液中觀(guān)察72 h后，對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)正常。結(jié)果與對(duì)照組相比SINV、EMCV、PPV和PRV病毒滴度都降低4Log10以上。

4 討論

將SINV、EMCV、PPV和PRV病毒摻入到凝血酶原液后，經(jīng)亞甲基藍(lán)可有效滅活病毒，經(jīng)超濾法濾除可有效去除病毒。摻入到凝血酶原液中的病毒以及在原培養(yǎng)物中病毒都喪失了對(duì)細(xì)胞的感染性，滴度降低4Log10以上，而其他對(duì)照顯示處理后的注射液對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。以上結(jié)果說(shuō)明這兩步工藝均符合《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則［S］GPH3-1》和國(guó)食藥監(jiān)注［2008］《關(guān)于發(fā)布化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求的通知》的要求，證明兩種方法均是有效的滅活/去除病毒工藝。

［1］ Chapman W C，Singla N，Genyk Y，et al.A phase 3，randomized，double-blind comparative study of the efficacy and safety of topical recombinant human thrombin and bovine thrombin in surgical hemostasis［J］.JAm Coll Surg，2007，205(2):256-265.

［2］ Gray G C，McCarthy T，Capuano A W，et al.Swine workers and swine influenza virus infections［J］.Emerg Infects Dis，2007，13:1871-1878.

［3］ Floyd R A，Schneider JE，Dittmer D P.Methylene blue photoinactivation of RNA viruses［J］.Antiviral Res，2004，61(3):141-151.

［4］ 文 輝，王小芳，黃 毅，等.吩噻嗪類(lèi)化合物的合成及其光化學(xué)病毒滅活活性研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010(1):72-76.

［5］ 余 偉，趙 輝，劉文芳.病毒滅活/去除工藝與血液制品病毒安全性［J］.中國(guó)輸血雜志，2009，22(7):606-610.

［6］ 周學(xué)勇，魏 家，胡 珉，等.病毒滅活血漿制備流程的建立及其對(duì)血漿質(zhì)量的影響［J］.臨床輸血與檢驗(yàn)，2011，13(4):332-334.

［7］ Moog R，Reichenberg S，Hoburg A，et al.Quality of methyleneblue-treated fresh-frozen plasma stored up to27 months［J］.Transfusion，2010，50(2):516-518.

［8］ 朱文赫，孫妙囡，孫德軍.核糖核酸Ⅱ制備及其病毒滅活工藝的驗(yàn)證［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2008，29(5):332-334.

［9］ 孫妙囡，孫德軍，王智鼎.肌氨肽苷制備工藝及其病毒去除方法的驗(yàn)證［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2008，29(6):395-397.

［10］殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，1997.

［11］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

The validation experiments of Methylene blue virus inactivation/removal process on swine thrombin

WANG Zhi-ding1，SONG Yan1，SUN Li2，SUN De-jun1
(1.Department of Biomedicine，Institute of Frontier Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China;2.Yuan Da Guo Ao Pharmacy Co.，Ltd.，Changchun，Changchun 130012，China)

Purpose To test the result of methylene blue virus inactivation/removal process on swine thrombin and to improve the production process.Methods Adding 0.5 mg/L methylene blue on Sindbis virus，of EMCV and PPV and PRV viruses，then putting them in the inactivated virus illumination instrument for 2 hours and using 60 kD ultrafiltration method to validate the feasibility of the process to inactivated virus.Results Methylene blue inactivated and filter virus could effectively remove the virus by ultrafiltration.Viruses which were incorporated into thrombin and in the original culture，lasty lose the ability to cell infection，and reduce the TCID50higher than 4Log10.Conclusion Methylene blue virus inactivation/removal process can effectively inactivate the virus in swine thrombin.

thrombin;methylene blue;virus

TQ464.8

A

1005-1678(2012)06-0797-03

2012-05-28

王智鼎，男，碩士研究生，主要從事生物藥物與分子靶向藥物研究，Tel:0431-85619233，E-mail:wzdfjfn@126.com。