焦 嫚，董學(xué)芝，胡衛(wèi)平，王 鑫

（河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院環(huán)境與分析科學(xué)研究所，河南開(kāi)封475004）

CdS-BSA-CTMAB熒光光度法測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量

焦 嫚，董學(xué)芝*，胡衛(wèi)平，王 鑫

（河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院環(huán)境與分析科學(xué)研究所，河南開(kāi)封475004）

實(shí)驗(yàn)以六偏磷酸鈉為穩(wěn)定劑，巰基乙酸為修飾劑水相合成了熒光試劑CdS量子點(diǎn)。結(jié)果表明，牛血清白蛋白（BSA）可使CdS的熒光峰增強(qiáng)，而陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）的加入，可使體系熒光峰顯著增敏，并且熒光強(qiáng)度與BSA濃度在8.0×10-5～1.3mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為F=1486.94793+937.70328C，相關(guān)系數(shù)R=0.9957，檢出限為7.4×10-5mg/mL。方法已用于食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定，與考馬斯亮藍(lán)法對(duì)照，結(jié)果滿意。

CdS量子點(diǎn)，十六烷基三甲基溴化銨，牛血清白蛋白

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，分子量大，主要由氨基酸通過(guò)酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來(lái)，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法主要有滴定法[1]、吸光光度法[2]、熒光法[3]、共振瑞利散射法[4]、電感耦合等離子體法[5]、流動(dòng)注射法[6]等。熒光法因具有多種測(cè)定參數(shù)、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用廣泛，利用有機(jī)染料結(jié)合的熒光探針技術(shù)也倍受關(guān)注[7]。近年來(lái)，量子點(diǎn)（QDs）作為一種具有優(yōu)異光學(xué)性質(zhì)的熒光生物探針，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)有機(jī)染料存在的缺陷，在蛋白質(zhì)分析方面具有很好的應(yīng)用前景[8]。近幾年，利用熒光量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白質(zhì)分子研究其作用機(jī)理已有報(bào)道[9]，但是用該生物探針測(cè)定蛋白質(zhì)的含量報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以六偏磷酸鈉為穩(wěn)定劑，巰基乙酸為修飾劑水相合成了熒光試劑CdS量子點(diǎn)，研究表明，牛血清白蛋白可使CdS的熒光峰增強(qiáng)，而陽(yáng)離子表面活性劑CTMAB的加入，可使體系熒光峰顯著增敏，并且熒光強(qiáng)度（F）與BSA濃度在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。據(jù)此，建立了CTMAB熒光增敏測(cè)定蛋白質(zhì)含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液（10mg/mL） 取牛血清白蛋白（BSA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生化試劑，≥98%）1g，用水稀釋定容至100mL；B-R緩沖溶液 取濃度均為0.04mol/L的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至所需pH；硼酸-硼砂緩沖溶液 取0.2mol/L的硼酸和0.05mol/L的硼砂混合調(diào)至所需pH；十六烷基三甲基溴化銨（1.10mol/L）、巰基乙酸（0.10mol/L）、六偏磷酸鈉（0.10mol/L）、CdCl2（0.10mol/L）、Na2S（0.10mol/L） 所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 二次蒸餾水。

F-7000熒光光度計(jì) 日本日立Hitachi公司；Labtech-1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司；pHS-3CT型酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；CL-4型恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 CdS量子點(diǎn)的制備

在80mL的燒杯中，依次加入蒸餾水50mL、CdCl22mL、六偏磷酸鈉3mL、巰基乙酸5mL，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到7.0。在攪拌的作用下，緩慢加入Na2S 3mL，反應(yīng)2h，得到一定粒徑大小的CdS。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在10mL容量瓶中，加入3.0mL CdS溶液、2.5mL B-R緩沖溶液、含適量BSA的溶液，CTMAB 1.8mL，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。于15℃反應(yīng)25min，在Ex 370nm，Em 530nm處進(jìn)行熒光測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

激發(fā)光譜為370nm，分別對(duì)CdS、BSA、CdS-BSA體系及含不同量CTMAB的CdS-BSA-CTMAB體系進(jìn)行熒光掃描，熒光光譜見(jiàn)圖1?？梢钥闯?，CdS在發(fā)射光譜530nm處有最大吸收峰，BSA本身在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，二者作用后使CdS-BSA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而CTMAB的加入，可使體系熒光強(qiáng)度增敏顯著。體系的熒光強(qiáng)度隨BSA濃度的增大逐漸增強(qiáng)，并且在一定范圍內(nèi)與BSA濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra

2.2 pH的影響、緩沖體系及用量的選擇

圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of acidity

配制一系列不同pH的B-R緩沖溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定不同酸度下的熒光強(qiáng)度F，以F對(duì)不同酸度（pH）作圖（圖2）。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)體系的pH在2.0～8.0范圍內(nèi)，體系F隨pH的增大逐漸增大，且在pH為8.50時(shí)F達(dá)到最大，實(shí)驗(yàn)選擇pH為8.50的緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)對(duì)硼酸-硼砂、NH3-NH4Cl及B-R緩沖溶液進(jìn)行選擇，表明pH為8.50的硼酸-硼砂緩沖溶液使體系熒光強(qiáng)度增加顯著。進(jìn)一步對(duì)pH8.50的硼酸-硼砂緩沖溶液的用量進(jìn)行選擇，見(jiàn)圖3。緩沖溶液用量在0～2.0mL范圍內(nèi)，F(xiàn)隨著緩沖溶液用量的增大逐漸增加，且在2.0mL后體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)選擇pH8.50的硼酸-硼砂緩沖溶液2.5mL。

圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of buffer volume

2.3 CdS用量的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，固定其他條件不變，測(cè)定體系在CdS不同用量時(shí)的熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)表明，隨著CdS用量的增多，體系熒光強(qiáng)度逐漸增大，且在3.0mL以后趨于穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)選擇CdS的用量為3.5mL。

圖4 CdS用量的影響Fig.4 Effect of CdS volume

2.4 CTMAB溶液用量的選擇

按照實(shí)驗(yàn)方法，固定其他條件不變，測(cè)定體系在CTMAB不同用量時(shí)的熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)表明，CTMAB用量在0～0.8mL范圍內(nèi)，隨著用量的增多體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大，且在0.8～1.8mL體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，大于1.8mL后熒光強(qiáng)度逐漸降低，實(shí)驗(yàn)選擇CTMAB的用量為1.5mL。

圖5 CTMAB用量的影響Fig.5 Effect of CTMAB volume

2.5 反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響

用溫度控制儀調(diào)節(jié)水溫，在10～70℃溫度范圍內(nèi)分別測(cè)定溫度對(duì)體系的影響，見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，10～25℃體系的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，隨著溫度的繼續(xù)升高，F(xiàn)逐漸降低。實(shí)驗(yàn)選擇溫度為15℃，測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的影響，見(jiàn)圖7。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)，體系熒光強(qiáng)度不穩(wěn)定，20min后，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，因此選定反應(yīng)時(shí)間為20min。

表1 樣品中BSA的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of BSA samples

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 2 Recovery test

圖6 反應(yīng)溫度的影響Fig.6 Effect of temperature

圖7 時(shí)間的影響Fig.7 Effect of time

2.6 工作曲線

按照實(shí)驗(yàn)方法，加入不同量的BSA，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度F對(duì)BSA濃度C作圖，如圖8所示。實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)與BSA濃度在8.0×10-5～1.3mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為F=1487+937.7C（mg/mL），相關(guān)系數(shù)R=0.9957，檢出限為7.4×10-5mg/mL。

2.7 共存離子的干擾

考察了常見(jiàn)的金屬離子及多種氨基酸對(duì)含有0.02mg/mL BSA體系的影響，結(jié)果表明，在±5%誤差允許范圍內(nèi)，500倍的NaCl、CaCl2、KCl、尿素、蔗糖、BaCl2，250倍的甘氨酸、L-谷氨酸、MgCl2，對(duì)實(shí)驗(yàn)均沒(méi)有影響，同濃度的Zn2+、Cu2+、Pb2+、Al3+、Fe3+有明顯的干擾，可加入不同的掩蔽劑進(jìn)行消除。

圖8 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curv

2.8 樣品測(cè)定及對(duì)照實(shí)驗(yàn)

取新磨好的豆?jié){（不加熱）200mL，肉松13.8044g，分別加水稀釋并定容至100mL，超聲振蕩3h，使樣品中蛋白質(zhì)充分溶解，用乙醚萃取三次，除去脂肪，過(guò)濾。即為待測(cè)液，備用。取樣品測(cè)試液，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，并與考馬斯亮藍(lán)法做對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

吸取一定量的樣品測(cè)試液，分別加入一定量的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)論

利用表面活性劑對(duì)CdS-BSA體系有增敏的作用，采用熒光法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、線性范圍寬，通過(guò)測(cè)定樣品并與標(biāo)準(zhǔn)方法做對(duì)照，結(jié)果滿意，可用于食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

[1]大連輕工業(yè)學(xué)院，華南理工大學(xué)，鄭州輕工業(yè)學(xué)院.食品分析[M].第一版.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009：214-216.析[M].第一版.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009：214-216.

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Determination of protein in food by CdS-BSA-CTMAB fluorometry

JIAO Man，DONG Xue-zhi*，HU Wei-ping，WANG Xin
（Henan University，Institute of Environmental and Analytical Sciences，College of Chemistry and Chemical Engineering，Kaifeng 475004，China）

CdS quantum dots（QDs）which had special spectral properties were prepared with sodium hexametaphosphate as stabilizer and mercapto-acetic acid as modifier by hydrothermal synthesis method.The results showed that the fluorescence intensity increasing after CdS reacted with novine serum albumin（BSA），but joined cetyltrimethy lammonium bromide（CTMAB）into system，the fluorescence increasing sensitivity.And the fluorescence intensity of system had a good linear relationship with the concentration of BSA in the range of 8.0×10-5～1.3mg/mL，and the linear equation was F=1486.94793+937.70328C，relation coefficient（R）was 0.9957，the limit of detection was 7.4×10-5mg/mL.The method have been used for determination of protein in food，and compared with the standard method（Coomassie brilliant blue method），the results were satisfactory.

CdS quantum dots；cetyltrimethy lammonium bromide（CTMAB）；bovine serum albumin（BSA）

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0334-04

2010-05-26 *通訊聯(lián)系人

焦嫚（1985-），女，碩士，研究方向：食品與藥物分析。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20875022）；省部共建河南大學(xué)科研項(xiàng)目。