吳洪斌，王永剛，劉成江，王俊剛，趙志永，金新文，*

（1.新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子832000；2.鶴壁職業(yè)技術學院，河南鶴壁458030）

新疆紅棗多糖酶法提取工藝研究

吳洪斌1，王永剛2，劉成江1，王俊剛1，趙志永1，金新文1，*

（1.新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子832000；2.鶴壁職業(yè)技術學院，河南鶴壁458030）

以新疆紅棗為原料，利用纖維素酶對紅棗多糖進行提取，通過響應面設計優(yōu)化最佳提取工藝，旨在提高紅棗多糖提取含量。實驗證明，酶添加量0.85mg/mL、酶解時間60min、酶解溫度50.0℃、液料比10∶1為紅棗多糖最佳提取條件，其多糖提取含量達7.71%。通過對上述各種因素的優(yōu)化，確定了紅棗多糖的最佳提取條件，為相關生產(chǎn)加工企業(yè)提供一定的參考依據(jù)和理論支持。

紅棗，多糖，纖維素酶，提取工藝

紅棗（Zizyphus Jujube Mill）又名大棗、華棗，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實。紅棗原產(chǎn)于我國，是我國的特產(chǎn)果品，栽培面積及產(chǎn)量均占世界的90%以上[1]。紅棗營養(yǎng)豐富，富含糖類、粗纖維、維生素、氨基酸、礦物質等營養(yǎng)成分，具有多種營養(yǎng)保健功能[2]。多糖（Polysaccharide）又稱多聚糖，是由單糖聚合而成的高分子化合物，廣泛存在于動植物的組織中。目前有相關研究表明，紅棗多糖可提高小鼠血液、肝臟及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）活性[3]；可使運動小鼠部分組織的抗氧化酶活性發(fā)生不同程度的良性變化，減少自由基生成，提高機體免疫力[4]；硫酸化修飾可顯著增強紅棗多糖對超氧化物陰離子、羥自由基、DPPH自由基的清除作用[5]；另外紅棗多糖還具有較強的抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等作用[6-10]。由上述研究結果可以看出，紅棗多糖在改善人體生理功能方面起到至關重要的作用。因此，進行提取紅棗多糖工藝研究，確定其最佳工藝參數(shù)，進而提高紅棗多糖的含量，具有重要的意義。本實驗通過研究紅棗多糖的提取工藝，對酶添加量、酶解時間、酶解溫度及液料比等因素進行優(yōu)化，確定紅棗多糖最佳提取工藝，為相關生產(chǎn)加工企業(yè)提供一定的參考依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 產(chǎn)自新疆阿克蘇農(nóng)一師，紅棗經(jīng)挑選、水洗后，放置在真空干燥箱中60℃干燥12h，去核后粉碎至粒度為80目的粉末，作為原料待用；無水乙醇、丙酮、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚 天津市風船化學試劑科技有限公司；纖維素酶 sigma公司；以上普通試劑 均為分析純；酶 均為生化試劑。

DZF-6050真空干燥箱 上海鴻都電子科技有限公司；SHHW21.600AⅡ三用電熱恒溫箱 天津市泰斯特儀器有限公司；LGJ-18S冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；TGL-10B高速離心機 上海安亭科學儀器廠；BS223S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；PHSJ-3F實驗室pH計、752N紫外可見分光光度計 上海精科。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅棗多糖提取工藝 紅棗粉→酶法浸提→滅酶→抽濾殘渣→減壓濃縮→乙醇沉淀多糖→冷凍干燥→紅棗粗多糖→復溶→脫色→脫蛋白→乙醇沉淀多糖→冷凍干燥→精制多糖

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制 準確稱取在105℃烘干至恒重的分析純葡萄糖0.01g，配制成0.1mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別移取上述葡萄糖標準液1、2、3、4、5、6mL放置于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到不同濃度梯度的葡萄糖溶液。分別移取1mL上述溶液置于10mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液1.0mL及5mL濃硫酸。充分混合后置于100℃水浴中，靜置30min。取出迅速冷卻至室溫，在490nm處進行比色。以濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：y=0.0067x+0.0002，R2=0.9988。

1.2.3 紅棗多糖提取工藝單因素實驗 通過參考大量相關文獻和進行預實驗，選擇適宜的因素水平進行單因素實驗，除待定因素外，其他參數(shù)均為最優(yōu)水平：液料比為10∶1，酶解溫度為50℃，酶解時間為60min，酶添加量為0.9mg/mL，結果以紅棗多糖提取率為評判標準。其方法如下：酶添加量：液料比10∶1，酶解溫度50℃，酶解時間為3h，酶添加量分別為0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL，實驗重復3次；酶解時間：液料比為10∶1，酶解溫度為50℃，酶添加量為0.9mg/mL，酶解時間分別為20、40、60、80min，實驗重復3次；酶解溫度：液料比為10∶1，酶添加量為0.9mg/mL，酶解時間為3h，酶解溫度分別為30、40、50、60℃，實驗重復3次；液料比：酶解溫度為50℃，酶添加量為0.9mg/mL，酶解時間為3h，液料比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，實驗重復3次。

1.2.4 紅棗多糖提取工藝響應面實驗 根據(jù)Design-Expert 7.0軟件Box-Behnken的組合實驗設計原理，確定響應面設計每個因子的適宜范圍。在單因素實驗基礎（酶添加量0.9mg/mL，酶解時間60min，酶解溫度為50℃，液料比為10∶1）上，選取酶添加量（A，mg/mL）、酶解時間（B，min）、酶解溫度（C，℃）、液料比（D，mL/g）四因素為自變量，各自變量的低、中、高實驗水平分別以-1，0，1編碼，因素及水平編碼見表1。

表1 響應面實驗水平及編碼設計Table 1 Level and code of variables of response surface method

1.2.5 測定方法 多糖的測定方法：采用苯酚硫酸法[11]進行測定（多糖含量以葡萄糖計）。

多糖提取率（%）=（提取液中多糖的含量/紅棗干物質）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均做平行實驗，采用Design-Expert 7.0數(shù)據(jù)處理軟件，進行響應面數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 紅棗多糖單因素實驗結果分析

通過上述實驗操作，得到各因素影響如圖1所示。

圖1 各因素對紅棗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different factors on extract yield

通過對上述單因素結果分析可知，隨著酶解溫度的增加，紅棗多糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在50℃時達到最大。紅棗多糖提取率在50℃后開始下降是由于溫度升高導致酶活性降低，酶促作用受到抑制，從而引起提取率下降，因此，選擇酶解溫度為50℃較為合適；隨著液料比的增加，紅棗多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢，但是在10∶1之后，上升趨勢變緩，從經(jīng)濟成本角度分析，選擇液料比10∶1較為合適；在酶添加量為0.6～0.9mg/mL時，隨著酶添加量的增加，多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢，當添加量＞0.9mg/mL時，提取率增加平緩。可能由于當酶添加量為0.9mg/mL時，底物已與酶結合完全，酶添加量的增加不會改變底物與酶的結合狀況。考慮到酶添加量的增加將會增加成本，選擇酶添加量為0.9mg/mL較為合適；隨著酶解時間的增加，紅棗多糖含量呈現(xiàn)上升趨勢，60min以后上升趨勢不明顯。分析是由于60min以后酶與底物已充分反應。為減少因酶解時間增加而帶來的能源浪費，提高效率，綜合提取率及成本考慮，選擇60min較為合適。通過上述分析，單因素篩選出各因素的最佳條件分別為酶添加量0.9mg/mL、酶解時間60min、酶解溫度為50℃、液料比為10∶1。

2.2 響應面結果分析

本次共29個實驗，1～24個實驗是析因實驗，25～29是中心實驗。其中析因點為自變量，取值在由四個因素構成的三維頂點；0點為區(qū)域的中心點，0點實驗重復5次，用來估算實驗誤差。對酶添加量、酶解時間、酶解溫度、液料比進行編碼，以紅棗多糖提取率為響應值，實驗方案及結果見表2。

2.2.1 效應模式的選擇 選擇何種效應模式對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，是得到最適當?shù)南鄳婺Ｐ偷年P鍵步驟，對實驗數(shù)據(jù)進行線性（Linear）、兩因子交互作用（2FI）和二階效應（Quadratic）三種模式的方差分析，結果如表3所示。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 The experiment design and results of response surface method

表3 不同效應模式方差分析表Table 3 Analysis of variance of different effect model

由表3分析可知，線性（Linear）及兩因子交互作用（2FI）模式下的回歸項，模型p值為0.7081及0.9252，說明70.8%和92.5%的F值變異是由誤差造成的，兩種模式的失擬項均小于0.01（0.0043、0.0028），說明兩種模式下回歸方程在回歸空間內擬合度很差。在二階效應（Quadratic）的模型下，該模型回歸極顯著（p＜0.01），表明僅有小于0.01%的F值變異是由誤差造成的；失擬性不顯著（P＞0.05），說明回歸方程在回歸空間內有較好的擬合度，可用回歸方程進行預測。綜合考慮，應選擇二階效應模型對數(shù)據(jù)進行模型分析。在選定的二階效應模型下，對響應面進行方差分析，結果如表4所示。

表4 響應面方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface method

由表4分析可知，該模型回歸極顯著（p＜0.01），失擬性不顯著（P＞0.05），說明可用回歸方程進行預測。方程系數(shù)R2=0.9278，不良適配度僅有0.0722，顯示響應值與各變量之間的回歸系數(shù)呈現(xiàn)高比例，代表回歸線與回歸數(shù)據(jù)間的相對適配度較好，上述四因素可解釋92.8%的響應值的變化建立的模型準確度高。信噪比（Adeq Precision）=12.04＞4，說明此模型可準確的反映實驗結果。分析結果顯示，酶添加量、酶添加量與液料比交互作用、酶解溫度液料比交互作用、加酶量的二次項、酶解時間二次項、酶解溫度的二次項、液料比的二次項對紅棗多糖紅棗的提取率影響顯著（p值分別為：0.0054，0.0130，0.0391，＜0.0001，＜0.0001，＜0.0001及＜0.0001，均小于0.05）。根據(jù)參數(shù)分析結果得到紅棗多糖提取率的二階響應面回歸模型為：

Y=-36.02+12.07A+0.16B+0.67C+3.50D-0.03AB-0.05AC+0.63AD+3.33×10-4BC-5.00×10-3BD+8.75×10-3CD-8.42A2-8.56×10-4B2-7.45×10-4C2-0.21D2

此回歸模型的R2=0.9278，F(xiàn)=12.85，p＜0.00001，說明模型在概率a=0.01水平上能夠擬合實驗數(shù)據(jù)，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。2.2.2 各因素相互作用的影響 上述響應面方程中各個因素交互作用影響可通過圖2～圖7所展示的響應面三維圖及等高線圖反映出來。等高線的形狀可反映出交互作用的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。通過等高線可以直觀看出AD兩因素、BD兩因素間交互作用顯著，即酶添加量與液料比、酶解時間與液料比之間交互作用顯著，與方差分析表中結論相同（表4）。從三維圖可以看出，過高或過低的各因素水平對紅棗多糖提取率均有不利的影響。經(jīng)分析認為隨著酶添加量的增加，反應速度加快，但是該反應為可逆反應，正反應增加的同時，逆反應也在增加，當酶用量大于0.85mg/mL時，酶添加量過大，反應系統(tǒng)中總含水量增加，反應向逆方向進行，提取率下降；溫度對酶法提取的影響主要有以下兩方面：在溫度較低的情況下，提高溫度可加快酶提速度，一般來說，溫度增加10℃，反應速度增加1～2倍；當溫度上升到該酶的變性溫度時，會完成酶的變性過程。隨著酶活力的喪失，酶解能力下降，進而引起提取率下降；酶解時間和液料比兩因素對提取率的影響較小，隨著兩因素用量的增加，提取率呈現(xiàn)前期快速上升后期變化平緩的趨勢，從經(jīng)濟成本角度考慮，選擇在響應面設計的0點水平較為合理。響應面方差分析及單因素結果亦可從其他角度得出相同結論。

圖2 酶添加量和酶解時間對紅棗多糖提取率的響應面Fig.2 Surface response plot of extract time and enzyme concentration on extract yield

圖3 酶添加量和酶解溫度對紅棗多糖提取率的響應面Fig.3 Surface response plot of extract temperature and enzyme concentration on extract yield

圖4 酶添加量和液料比對紅棗多糖提取率的響應面Fig.4 Surface response plot of liquid to solid ratio and enzyme concentration on extract yield

圖5 酶解時間和酶解溫度對紅棗多糖提取率的響應面Fig.5 Surface response plot of extract temperature and extract time on extract yield

圖6 酶解時間和液料比對紅棗多糖提取率的響應面Fig.6 Surface response plot of liquid to solid rate and extract time on extract yield

圖7 酶解溫度和液料比對紅棗多糖提取率的響應面Fig.7 Surface response plot of extract temperature and liquid to solid ratio on extract yield

2.2.3 反應條件的優(yōu)化及模型驗證 根據(jù)最低成本及最大效益的原則，由回歸模型來預測最佳反應條件。利用Design Expert分析，其最佳條件為：酶添加量為0.85mg/mL，酶解時間59.03min，酶解溫度為49.18℃，液料比為10.01∶1，其多糖提取率達7.67%。

為了驗證模型方程的適用性，同時考慮到操作的方便性，將上述條件調整為酶添加量為0.85mg/mL，酶解時間60min，酶解溫度為50℃，液料比為10∶1，平行進行五組實驗，最后得到多糖提取率平均值為7.71%，接近預測值。說明實驗結果與模型擬合良好，建立的回歸模型能真實地反映酶添加量、酶解時間、酶解溫度及液料比對紅棗多糖提取率的影響，通過此模型優(yōu)化能夠有效地提高紅棗多糖的提取率。

2.3 所得樣品性質測定

所得多糖樣品為淡黃色粉末，無味，易溶于熱水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑；經(jīng)比色反應測定，苯酚硫酸、蒽酮反應均呈陽性，可證明樣品為糖類化合物。茚三酮反應呈微弱陽性，說明樣品中還有少量殘余的蛋白質，需對其進行進一步的純化分離。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上，采用響應面設計實驗，采用二次多項式逐步回歸方法，確定了紅棗多糖的最佳提取工藝。發(fā)現(xiàn)在酶添加量0.85mg/mL，酶解時間60min，酶解溫度為50℃，液料比為10∶1條件下，得到的紅棗多糖提取率為7.71%，相比其他相關報告均有顯著性提高[12-13]。該工藝參數(shù)可用于實際生產(chǎn)中，對于相關生產(chǎn)加工企業(yè)具有一定的參考價值和理論指導意義。

[1]袁亞紅，高振鵬，史亞歌.我國紅棗的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2002，30（9）：95-98.

[2]王軍，張寶善，陳錦屏.紅棗營養(yǎng)成分及其功能的研究[J].食品研究與開發(fā)，2003，24（2）：68-72.

[3]李小平，陳錦屏.紅棗多糖沉淀特性及抗氧化作用[J].食品科學，2005，26（10）：214-216.

[4]王海元.紅棗多糖對小鼠運動能力的影響及其機理的探究[D].金華：浙江師范大學，2009.

[5]焦中高，劉杰超，周洪平，等.硫酸化修飾對紅棗多糖自由基和亞硝基清除活性的影響[J].中國食品學報，2007，7（2）：17-20.

[6]Chang SC，Hsu BY，Chen BH.Structural characterization of polysaccharides from Zizyphus jujuba and evaluation of antioxidant activity[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010（47）：445-453.

[7]Li Jinwei，Liu Yuanfa，Lian zhong Ai，et al.Antioxidant activities of polysaccharides from the fruiting bodies of Zizyphus jujuba cv. jinsixiaozao[J].Carbohydrate Polymers，2011，84：390-394.

[8]Li Jinwei，F(xiàn)an Liuping，Ding Shaodong.Isolation，purification and structure of a new water-soluble polysaccharide from Zizyphus jujuba cv.j insixiaozao[J].Carbohydrate Polymer，2011，83：477-482.

[9]Wang Bing.Chemical characterization and Ameliorating effect of polysaccharide from Chinese jujube on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，48：386-391.

[10]Zhang Hao，Lu Jiang，Shu Ye，et al.Systematic evaluation of antioxidant capacities of the ethanolic extract of different tissues of jujube（Zizyphus jujuba mill.）from China[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48：1461-1465.

[11]Dubois M，Gilles KA，Hamilton JK，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28：350-356.

[12]唐彥君，王桂華，魏文毅，等.紅棗多糖提取工藝研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2008，20（4）：64-66.

[13]李杰，梁長利，米芳.水溶性紅棗多糖提取純化工藝的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2008，20（10）：92-94.

Study on the enzyme extraction technology of polysaccharide from Xinjiang Zizyphus Jujube

WU Hong-bin1，WANG Yong-gang2，LIU Cheng-jiang1，WANG Jun-gang1，ZHAO Zhi-yong1，JIN Xin-wen1，*
（1.Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi 832000，China；2.Hebi College of Vocation and Technology，Hebi 458030，China）

Choosing Xinjiang Zizyphus Jujube as raw material and using cellulase to extract polysaccharide from Zizyphus Jujube，the extraction yield of Zizyphus Jujube polysaccharide could be improved with the optimizing extract technology through response surface method（RSM）.The best extraction condition was liquid solid ratio of 10∶1，temperature of 50℃，extraction time of 60min，and enzyme volume of 0.85mg/mL.Under this condition，the Zizyphus Jujube polysaccharide extract yield was up to 7.71%.Reference basis and theory support could be provided to some relative manufactories when the reasonable process was decided through the study of the best extraction condition of Zizyphus Jujube polysaccharide.

Zizyphus Jujube；polysaccharide；cellulase；extraction technology

TS255.1

B

1002-0306（2012）05-0292-05

2011－04－28 *通訊聯(lián)系人

吳洪斌（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與農(nóng)產(chǎn)品加工。

兵團科技攻關項目（2010GG61）。