張 汆，李 敏，賈小麗

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000）

芡種殼乙酸乙酯提取物的毛細管電泳法分離

張 汆，李 敏，賈小麗

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000）

芡植株各組織器官中均含有豐富的酚類物質(zhì)，其中以實種殼中多酚含量最高（183.037mg/g，干基），其次為塊根、葉及芡果皮。為分析芡種殼乙酸乙酯提取物的化學成分，采用高效毛細管電泳（HPCE）法對芡種殼乙酸乙酯提取物進行分離，并以標準物為對照，對其主要成分進行初步定性。結(jié)果顯示，HPCE法可用于芡種殼乙酸乙酯提取物（EAE）中多酚類物質(zhì)的分離，其分離條件為：彈性石英毛細管柱（總長42.5cm，有效長度34cm），電泳緩沖液由200mmol/L硼酸、5.4mmol/L β-CD、10mmol/L KH2PO4和27.5%乙腈組成，檢測波長230nm，壓力進樣50mbar，5s，電壓20kV，柱溫20℃。初步分析認為，芡種殼乙酸乙酯提取物中基本不含兒茶素、表兒茶素和蘆丁，含少量綠原酸組分。

芡種殼，乙酸乙酯提取物，高效毛細管電泳，分離

芡實是睡蓮科芡屬植物芡（Euryale ferox Salisb.）的成熟種仁，又稱雞頭米。芡實是我國傳統(tǒng)的中藥原料和滋補食材，具有多種生理保健功能，被視為延年益壽的上品[1-2]。芡實種子外被一層厚約1～2mm的木質(zhì)堅硬外殼覆蓋，去殼是其加工的第一步。芡種殼約占其種子質(zhì)量的30%～40%，是芡米加工中的主要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量在3000t以上，尚未開發(fā)利用。研究表明，芡實果皮[3-4]、種仁[5-6]以及芡種殼、莖、葉、果皮、根莖中均含有豐富的植物多酚類物質(zhì)。其中芡種殼的總酚含量最高（17.76%），是提取植物多酚物質(zhì)的理想原料。多酚物質(zhì)作為植物組織中的一種次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于各種植物源食物和中藥材中，具有多種生理活性，而有關芡種殼中多酚物質(zhì)的組成及其生理活性目前還不了解。高效毛細管電泳（High performance capillary electrophoresis，HPCE）是一種較新型的分析技術，具有快速、靈敏、環(huán)保等優(yōu)點，已廣泛用于中藥材、醫(yī)藥、食品、保健品中功效成分的分析與鑒定[7-9]。本文采用乙酸乙酯對芡種殼中的多酚物質(zhì)進行分離提取，采用高效毛細管電泳（HPCE）技術對其分子結(jié)構(gòu)進行了初步分離和定性，為提高芡種殼資源的綜合利用率，為其在醫(yī)藥、保健品、食品添加劑領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡種殼 取當年產(chǎn)帶殼芡實，手工剪開芡種殼，取出芡實種仁，將芡種殼于40℃烘箱內(nèi)干燥后，粉碎（過80目篩網(wǎng)），裝入聚乙烯自封袋內(nèi)，于4℃冰箱內(nèi)貯藏備用；乙酸乙酯、焦性沒食子酸、硼酸、β-CD、KH2PO4、乙腈等 購自國藥集團上海試劑公司，均為分析純試劑；蘆丁、綠原酸、兒茶素和表兒茶素對照品 購自中國藥物檢驗所。

CP224s型電子天平 Sartorius AG Germany；L-550型離心機 湖南湘儀；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，雙華HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DGX-9073BC-1型電熱鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司；LGJ-10B型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；Cart 100型紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；G1600A型高效毛細管電泳儀（彈性石英毛細管柱，總長42.5cm，有效長度34cm），紫外檢測器 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組分測定 水分和揮發(fā)性物質(zhì)含量采用GB/ T5009.3-2003測定。

總酚含量的分析[10-11]：采用Folin-Ciocalteus（FC）試劑法，以焦性沒食子酸為標準物進行測定?？偡訙y定標準曲線方程為：總酚（mg）=0.1077×A680+0.0009，R2=0.9943。

1.2.2 芡種殼乙酸乙酯提取物（Ethyl Acetate Extract， EAE）制備[8，12]芡種殼→40℃干燥，粉碎（過80目篩）→用乙酸乙酯（pH調(diào)至5～6），超聲浸提（20℃，5min）2次→離心分離，合并上清液，減壓濃縮→真空冷凍干燥48h，即得淡黃色的提取物（EAE）。

1.2.3 多酚樣品組分的高效毛細管電泳（HPCE）分析[8-9]G1600A型高效毛細管電泳儀（美國Agilent公司），紫外檢測器。彈性石英毛細管柱，總長42.5cm，有效長度34cm。分別對緩沖體系及其濃度、電壓、進樣量、柱溫等條件進行了分析。電泳介質(zhì)、標準溶液和樣品溶液在進樣前均用微孔濾膜過濾。兩次進樣間用0.1mol/L NaOH、超純水和電泳介質(zhì)分別沖洗毛細管5min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均重復測定3次，取平均值。采用Excel和DPSv7.55數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡組織器官中總酚的分布

芡組織器官中總酚含量如表1所示。結(jié)果表明，芡植株各組織器官中均含有豐富的酚類物質(zhì)，其中以實種殼中多酚含量最高（183.037mg/g，干基），其次為塊根、葉、果實海綿質(zhì)以及芡果皮。由此可見，芡種殼、葉、根等均是提取植物多酚的良好資源。

此外，芡種仁是我國常用中藥材和滋補食材，其中的總酚含量為1.270mg/g（鮮重），要高于葡萄籽（1.005mg/g）[13]，但稍低于蘋果（1.32～2.67mg/g）[14]中的總酚含量。Samarjit Das等[15]、劉玉鵬等[16]研究表明，芡種仁提取物具有較強的保健功能和抗氧化活性。在前期研究的基礎上，結(jié)合前人的研究結(jié)果，分析認為，酚類物質(zhì)在芡實醫(yī)藥保健功能中可能扮演重要作用，而目前對芡實中多酚物質(zhì)的組成和生理活性還缺乏研究。

表1 多酚物質(zhì)在芡組織器官中的分布Table 1 The polyphonics distribution in gorgon nut frond tissues

2.2 EAE樣品中各組分的HPCE分離條件分析

為了解芡種殼多酚的分子組成，本實驗采用HPCE法對其進行分析，以下就HPCE的分析條件進行了初步探索。

2.2.1 電泳緩沖體系選擇 本實驗分別選擇磷酸鹽和硼酸兩種緩沖體系作為分離EAE樣品的電泳介質(zhì)，為增加分離效果加入β-CD。β-CD是一種常用的手性選擇劑，它能與對映體形成具有不同穩(wěn)定常數(shù)的包容配合物，借此實現(xiàn)對映體的分離[9]。此外，有機溶劑乙腈可以減小流動相的極性改變毛細管管壁的Zeta電勢，降低電滲流的速度，從而提高選擇性。

分析結(jié)果顯示，隨著電泳緩沖液中乙腈含量的增加，HPCE圖譜中各組分的遷移時間不斷延長，各峰之間分離度提高。通過調(diào)節(jié)硼酸、β-CD、KH2PO4和乙腈之間的比例，發(fā)現(xiàn)當200mmol/L硼酸、5.4mmol/L β-CD、10mmol/L KH2PO4和27.5%乙腈的混合溶液作為電泳緩沖液，壓力進樣50mbar，5s，在電壓20kV、柱溫30℃，檢測波長200nm時，各峰可以較好分離，共分離出12個峰，分析時間10min，最強峰出峰時間在6.5min處（如圖1）。

圖1 所選電泳緩沖液體系下EAE的HPCE圖譜Fig.1 The HPCE chromatography of EAE with elected buffer system

2.2.2 檢測波長的選擇 樣品EAE乙醇溶液紫外吸收圖譜（圖2A）顯示其最大吸收峰為278nm，而HPCE分離圖譜的3D圖（圖2B）顯示，樣品中各主要組分230nm處均有較強吸收，所以，本實驗選擇230nm作為EAE樣品的檢測波長。

2.2.3 電壓、柱溫和進樣量的選擇 在選定電泳緩沖液條件下，不同電壓（20～30kV）下的分析結(jié)果表明：隨著電壓的升高，基線噪聲增大，各峰之間分離度降低，總峰數(shù)減少，故選擇電泳分離電壓為20kV。隨著柱溫升高（20～30℃），組分的遷移時間縮短，但分離度降低，當柱溫為20℃時分析效果較合適。調(diào)整進樣為50mbar，3s后，各峰之間區(qū)分度降低，峰高也有所降低，故選擇壓力進樣條件為50mbar，5s。

圖2 樣品EAE溶液紫外吸收圖譜（A）及其HPCE分離圖譜的三維圖（B）Fig.2 The UV-absorption spectrum（A）of EAE sample solution and its three dimensional graphics（B）

因此，在本實驗條件下，樣品EAE適宜的HPCE分離條件為：電泳緩沖液體系由200mmol/L硼酸、5.4mmol/L β-CD、10mmol/L KH2PO4和27.5%乙腈組成。壓力進樣50mbar，5s，電壓20kV、柱溫20℃。在此條件下，樣品EAE中各組分可以獲得較好的分離，共分離出22個峰，分析時間15min，最高峰出峰時間為6.45min（圖3）。

圖3 樣品EAE的HPCE圖譜Fig.3 The HPCE atlas of sample EAE

2.3 EAE樣品中各組分的定性分析

在樣品EAE中各組分在現(xiàn)有實驗條件下得到較理想分離的條件下，以標準物質(zhì)對樣品EAE各組分進行初步定性分析。圖4是兒茶素、表兒茶素、蘆丁和綠原酸等4種標準物質(zhì)的HPCE圖譜。

在相同的電泳分析條件下，通過比對混合標準物質(zhì)和樣品EAE的HPCE圖譜，結(jié)合將4種標準物質(zhì)分別加入樣品EAE溶液后的HPCE圖譜變化，初步分析認為，樣品EAE中基本不含兒茶素、表兒茶素和蘆丁，含少量的綠原酸（圖5）。因本實驗中所用標準物質(zhì)種類有限，HPCE圖譜中峰面積最大的組分（保留時間6.45min）還不能確定其為何種物質(zhì)。

由于本實驗中所用芡種殼乙酸乙酯提取物（EAE）是一個多組分混合物，樣品EAE組成的確切定性還需對樣品做進一步的純化處理，并結(jié)合其他分析技術，如紫外、紅外、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法，這將是后續(xù)的研究內(nèi)容。

圖4 混合標準樣品的HPCE圖譜Fig.4 The HPCE atlas of mixed standard substances

圖5 添加標準物的樣品HPCE圖譜Fig.5 The HPCE atlas of EAE with standard substances addition

3 結(jié)論

芡植株各組織器官中均含有豐富的多酚物質(zhì)，其中以實種殼中多酚含量最高（183.037mg/g，干基），是提取植物多酚的良好資源。

高效毛細管電泳（HPCE）法分離芡種殼乙酸乙酯提取物（EAE）的條件為：彈性石英毛細管柱（總長42.5cm，有效長度34cm），電泳緩沖液由200mmol/L硼酸、5.4mmol/L β-CD、10mmol/L KH2PO4和27.5%乙腈組成，檢測波長230nm，壓力進樣50mbar，5s，在電壓20kV、柱溫20℃。在此條件下，樣品EAE中各組分得到了較好分離，共得到22個峰。

在HPCE法分離基礎上，采用標準物質(zhì)定性分析認為，芡種殼乙酸乙酯提取物（EAE）中基本不含兒茶素、表兒茶素和蘆丁，含少量綠原酸。HPCE圖譜中峰面積最大的組分（保留時間6.45min）還不能確定其為何種物質(zhì)。

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Preliminary separation and identification of the ethyl acetate extract from Gorgon Nut（Euryale ferox Salisb.）seed coat

ZHANG Cuan，LI Min，JIA Xiao-li
（School of Bioamp;Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，China）

The gorgon nut frond tissues contained much of phenolics，which was found most in gorgon nut seed coat（183.037mg/g，dry base），and the root，leaf and the fruit peel were followed.In order to analyze the components of ethyl acetate extract（EAE）from gorgon nut（Euryale ferox Salisb.）seed coat，the main components of EAE sample were separated by the high performance capillary electrophoresis（HPCE）method and preliminaryly identified with standards.The results showed the HPCE method could be used to separate the polyphenol in the EAE sample.Analysing conditions was：springy quartz capillary column（total length is 42.5cm，effect length is 34cm），the electrophoresis buffer was made of boric acid（200mmol/L），β-cyclodextrin（β-CD，5.4mmol/L），potassium dihydrogen phosphate（10mmol/L）and acetonitrile（27.5%），sampling press was 50mbar and 5 seconds，and at 230nm wave length，20kV and 20℃ column temperature.The results indicated that no catechin，epicatechin and lutin，and little chlorogenic acid were found in EAE sample.

Gorgon nut seed coat；ethyl acetate extract；high performance capillary electrophoresis（HPCE）；separation

TS201.2

B

1002-0306（2012）05-0223-04

2011-05-09

張汆（1970-），女，博士，副教授，研究方向：食品化學與營養(yǎng)學、膳食蛋白、功能食品。

安徽省應用化學省級重點學科建設項目（200802187C）；滁州市科技計劃項目（201057）。