胡能兵，何克勤，張子學，林 平，隋益虎，崔廣榮，2，*

（1.安徽科技學院植物科學學院，安徽鳳陽233100；2.安徽省甜葉菊工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠233000）

甜葉菊隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)優(yōu)化及親緣關(guān)系研究

胡能兵1，何克勤1，張子學1，林 平1，隋益虎1，崔廣榮1，2，*

（1.安徽科技學院植物科學學院，安徽鳳陽233100；2.安徽省甜葉菊工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠233000）

以甜葉菊為試材，對影響其隨機擴增多態(tài)性DNA標記反應(yīng)體系的7個因子進行優(yōu)化，同時對來自國內(nèi)外的12個品種進行親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，20μL的優(yōu)化體系包括：雙蒸水13.6μL，10×Buffer（含15mmol/L MgCl2）溶液3μL，2.5mmol/L的dNTPS 1.2μL，10μmol/L的引物1μL，20ng的模板DNA 1μL，1U Taq聚合酶；熱循環(huán)程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s，35℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環(huán)，最后72℃延伸7min。聚類圖結(jié)果表明，品種間的遺傳距離變異范圍為0.12～0.88，在遺傳距離為0.37時，8個引物可將12個品種分為四大類，來自日本的2個品種與國內(nèi)品種關(guān)系較遠。

甜葉菊，隨機擴增多態(tài)性DNA，優(yōu)化，親緣關(guān)系

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）簡稱甜菊、甜草、甜茶、蜜菊等，為菊科甜葉菊屬多年生草本植物，原產(chǎn)南美巴拉圭一帶，中國于1976年引種成功[1]。甜葉菊富含糖苷類物質(zhì)，其糖苷具有高甜度（為蔗糖250～450倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特點，在體內(nèi)不參與代謝、不蓄積、無毒性，被譽為是繼甘蔗、甜菜之后的世界第三大糖源。甜葉菊具有一定的藥理作用，對糖尿病、心臟病和高血壓等有較好的療效，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于保鍵飲料、低熱量食品和醫(yī)藥行業(yè)中[2]。目前，甜葉菊在國內(nèi)外的研究仍然處于起步階段，如栽培、離體快繁、糖苷鑒定及優(yōu)良單株篩選、品種選育等方面[2-8]，而日新月異的分子技術(shù)在甜葉菊上的研究，如優(yōu)異基因的分子標記、種質(zhì)資源指紋圖譜構(gòu)建卻鮮有報道，這給從事甜葉菊研究的各類人員，特別是期望品種得到保護的育種家提出新的課題。因此，在分子水平上開展這方面的研究已成為當前的首要任務(wù)。鑒于隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）技術(shù)具有操作簡便、快速、省時省力等優(yōu)點，一經(jīng)問世便在諸多植物的品種鑒定、種屬特異性研究、易混淆品種鑒別等方面發(fā)揮重要作用。本文擬首先對影響甜葉菊RAPD技術(shù)體系的7個主要因素進行優(yōu)化，建立穩(wěn)定的RAPD反應(yīng)系統(tǒng)，既為品種的指紋圖譜構(gòu)建奠定前期基礎(chǔ)，也為其它分子技術(shù)的優(yōu)化乃至后期的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甜葉菊雜交新品種“皖甜1號”等6個親本株 由蚌埠永生農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；RAPD體系中使用的Mg2+、dNTPS和Taq酶 購自北京康為世紀公司；引物 由上海Invitrogen公司合成；用于親緣關(guān)系分析的品種材料 見表1。

表1 不同甜葉菊品種及來源Table 1 Different cultivars and origins of Stevia rebaudiana Bertoni

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 采用胡能兵的CTAB法[9]。取2μL DNA于0.8%的瓊脂糖凝膠板上進行電泳檢測。

1.2.2 實驗設(shè)計 PCR體系優(yōu)化采用單因素實驗，按照下面順序依次開展：模板DNA濃度、dNTPS和Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度、Taq酶濃度和循環(huán)次數(shù)等，上述因子的處理水平見表2，下一個因子的優(yōu)化是基于上一個因子在實驗范圍內(nèi)獲得理想結(jié)果的基礎(chǔ)上進行。

1.2.3 基本反應(yīng)體系 用于RAPD反應(yīng)的20μL基本反應(yīng)體系為：雙蒸水12.2μL，10×Buffer（含15mmol/L MgCl2）溶液4μL，2.5mmol/L的dNTPS 1.6μL，10μmol/L的引物1μL，20ng的模板DNA 1μL，1U Taq聚合酶。其中，用于優(yōu)化反應(yīng)的RAPD引物分別為AZ：5'AGGCTAGGCT3'和BG：5'CGCAGACAGT3'。

表2 RAPD體系的因子及其水平Table 2 Factors and levels of RAPD system

1.2.4 PCR擴增反應(yīng) 基本的熱循環(huán)程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s，35℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物用0.5× TBE在1.5%瓊脂糖凝膠板上電泳，加樣量為6μL。電泳結(jié)束后用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.2.5 引物篩選 用日本品種“守甜3號”和國內(nèi)品種“ST”對100條RAPD引物進行篩選，入選的是兩品種同時能夠擴增及“守甜3號”未擴增出條帶而“ST”能擴增出條帶的引物。

1.2.6 親緣關(guān)系分析 用上述引物對12個品種同時進行擴增，對擴增后的條帶進行0、1標記，有帶的記為1，無帶的記為0，形成0/1矩陣。根據(jù)Nei和Li（1979）的方法，用DPS統(tǒng)計軟件中的類平均法（UPGMA）計算甜葉菊品種的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA提取質(zhì)量結(jié)果

隨機取6個親本單株的葉片提取DNA后進行瓊脂糖檢測。由圖1可知，所提取的DNA帶型整齊，純度高，無降解現(xiàn)象，經(jīng)紫外分光光度計檢測，DNA純度較高，其濃度達到20ng/μL。

圖1 利用CTAB法提取的DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis map by CTAB method

2.2 RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化分析

2.2.1 模板DNA和dNTPS濃度的優(yōu)化 以AZ、BG2個引物對4種不同濃度的模板DNA、dNTPS進行篩選，結(jié)果見圖2、圖3。在10ng的DNA濃度下，AZ引物所擴增的條帶較為模糊，呈彌散狀，而AZ、BG在其余濃度下表現(xiàn)條帶數(shù)目一致、產(chǎn)量相當，故入選20ng的模板DNA濃度；不同dNTPS濃度對RAPD條帶數(shù)目、產(chǎn)量影響較大。當dNTPS（2.5mmol/L）為0.4μL時，AZ引物未能擴增出條帶，當dNTPS為1.6μL時，AZ引物擴增的條帶類型減少（圖3箭頭所示），綜合比較0.8、1.2μL時的dNTPS在兩種引物的表現(xiàn)，以后者更為合適。

圖2 不同DNA濃度對AZ引物帶型的影響Fig.2 Effect of different DNA density on RAPD band

圖3 不同dNTPS濃度對AZ引物帶型的影響Fig.3 Effect of different dNTPS density on RAPD band

2.2.2 Mg2+和引物濃度的優(yōu)化 分別用4種Mg2+和引物濃度對引物AZ、BG進行擴增，結(jié)果見圖4、圖5。隨著Mg2+（15mmol/L）、引物濃度（10μmol/L）添加量的增加，條帶數(shù)和產(chǎn)物量也隨之增加，但3.0μL和4.0μL的Mg2+之間無明顯差異，低濃度的AZ引物會導致條帶缺失（圖5箭頭所示），當引物為1.0μL和1.5μL時，處理的產(chǎn)物量相當，故選擇3.0μL的Mg2+和1μL的10μmol/L引物為佳。

圖4 不同Mg2+濃度對帶型的影響Fig.4 Effect of different Mg2+density on RAPD band AZ（1～4）、BG（5～8）

圖5 不同引物濃度對帶型的影響Fig.5 Effect of different primer density on RAPD band AZ（1～4）、BG（5～8）

圖6 不同退火溫度對AZ引物帶型的影響Fig.6 Effect of different annealing temperature on RAPD band

圖7 不同Taq濃度對帶型的影響Fig.7 Effect of different Taq density on RAPD band under temperature of 35℃（35℃）AZ（1～4）、BG（5～8）

2.2.3 退火溫度及Taq濃度的優(yōu)化 12種退火溫度的優(yōu)化結(jié)果見圖6。在實驗區(qū)間內(nèi)，隨著退火溫度的提高，條帶數(shù)減少（圖6箭頭所示a），產(chǎn)物量降低（圖6箭頭所示b）。為了進一步驗證退火溫度對反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，結(jié)合Taq濃度進行體系的優(yōu)化，選擇了35、37℃這兩種溫度和4種Taq濃度進行實驗，結(jié)果見圖7、圖8。從退火溫度方面考慮，隨著溫度的提高，小片段比例增加，大片段比例減少，且體系不穩(wěn)定，表現(xiàn)為條帶的缺少（圖8箭頭所示c、d），而35℃條件下體系穩(wěn)定；從Taq濃度考慮，當Taq為0.25U時，都未能擴增出條帶，當Taq為0.5U，引物AZ未能擴增出條帶，引物BG的條帶模糊，說明擴增的產(chǎn)物量較少，綜合比較1.0U和2.0U的表現(xiàn)，確定前者為適合的Taq濃度。

2.2.4 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 設(shè)計4個不同次數(shù)的循環(huán)進行擴增，在2種引物中的表現(xiàn)見圖9。當循環(huán)數(shù)為30時，引物AZ未擴增出條帶，而引物BZ擴增出3條帶，將循環(huán)數(shù)提高至35時，2種引物都擴增出條帶，數(shù)目與40、45次循環(huán)一致，但產(chǎn)物量明顯減少，而40次循環(huán)和45次循環(huán)擴增在2種引物中未見差異，故選擇40次循環(huán)。

圖8 不同Taq濃度對帶型的影響（37℃）Fig.8 Effect of different Taq density on RAPD band under temperature of 37℃AZ（1～4）、BG（5～8）

圖9 不同循環(huán)數(shù)對RAPD帶型的影響Fig.9 Effect of different cycles on RAPD band AZ（1～4）、BG（5～8）

2.2.5 引物篩選及擴增結(jié)果 由表3及圖10、圖11可知，8個引物共擴增出36條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為35，多態(tài)性比例為97.2%，這主要是由于日本品種與國內(nèi)育種家所選育的品種親緣關(guān)系較遠所致。同時，由于引物AZ未能在d品種“守甜3號”中擴增出引物（圖11箭頭所示），故利用該引物可在分子水平上鑒別“守甜3號”與其它11個品種。

表3 引物的擴增結(jié)果Table 3 Amplification results of different primers

2.2.6 品種親緣關(guān)系分析 根據(jù)8個引物的擴增結(jié)果，用DPS軟件繪制出甜葉菊12個品種的親緣關(guān)系聚類圖（圖12）。由圖12可知，品種內(nèi)遺傳距離的變異范圍為0.12～0.88，國內(nèi)品種與來自日本的兩個品種，尤其是與“守甜3號”的親緣關(guān)系較遠。

圖10 引物B擴增結(jié)果Fig.10 Amplification results of primer BG

圖11 引物AZ擴增結(jié)果Fig.11 Amplification results of primer AZ

當遺傳距離為0.37時，可將上述12個甜葉菊品種分為四類。第一類是來自日本的品種“守甜3號”，第二類是品種“ST”，第三類包括兩個品種，分別為“守甜2號”和“加3”，其余的8個品種則聚為第四類。從聚類分析結(jié)果可知，來自日本的品種和中國的品種親緣關(guān)系較遠，這也為系統(tǒng)育種和雜種優(yōu)勢利用提供基礎(chǔ)。

圖12 12個品種親緣關(guān)系聚類圖Fig.12 Clustering map of relationship in 12 kinds of cultivars

3 結(jié)論

任何生物種都具有特定順序和結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)——DNA，RAPD技術(shù)就是通過分析遺傳物質(zhì)DNA經(jīng)過PCR擴增的多態(tài)性來診斷生物體內(nèi)在基因排布與外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的一項技術(shù)，該技術(shù)只需要一個長度為10bp的核苷酸為引物，其使用不必預先知道DNA序列的信息。因此，可以在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析[10]。

許多研究發(fā)現(xiàn)，RAPD帶譜對實驗程序和條件的變化很敏感。一般影響條帶的數(shù)目、大小和強度的因素有DNA條件和含量、引物濃度、dNTPS和Mg2+濃度、循環(huán)數(shù)、退火溫度、Taq酶濃度等[10]。本實驗采用單因素實驗，以上述7個因子對甜葉菊RAPD反應(yīng)體系開展優(yōu)化研究，探索合適的反應(yīng)體系。通過對RAPD反應(yīng)體系的7個因子的優(yōu)化表明，適合甜葉菊20μL的RAPD反應(yīng)體系為：雙蒸水13.6μL，10×Buffer（含15mmol/L MgCl2）溶液3μL，2.5mmol/L的dNTPS 1.2μL，10μmol/L的引物1μL，20ng的模板DNA 1μL，1U Taq聚合酶；熱循環(huán)程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s，35℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環(huán)，最后72℃延伸7min。利用該體系可以獲得穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物。

近10年來，各種不同分子標記技術(shù)在不同植物上的應(yīng)用見諸報端，其優(yōu)化方法也各不相同[12-15]。如辣椒RAPD優(yōu)化的單因素實驗法（馬艷青，2001）和回歸分析法（張子學等，2005），萬壽菊RAPD優(yōu)化的正交設(shè)計法（沈一嵐等，2006），金彈RAPD優(yōu)化的單因素實驗結(jié)合均勻設(shè)計法（張宏梓等，2009），天門冬ISSR優(yōu)化的單因素實驗和正交設(shè)計法（歐立軍等，2011），以單因素實驗法和正交設(shè)計法居多。在上述優(yōu)化方法中，單因素實驗法直觀、明了，但對于各因素在優(yōu)化體系中的重要性大小及因素之間的互作無法計算，其結(jié)果是局部最優(yōu)[14]；正交設(shè)計法屬于多因素多水平實驗方法，可以用較少的處理組合數(shù)研究較多的實驗因素，可估計各因素對結(jié)果的重要性大小，其最優(yōu)組合仍然屬于具體實施的實驗組合中；回歸分析法則通過建立方程，對入選因子進行優(yōu)化分析，比較因子之間的作用大小和互作效應(yīng)的影響，獲取穩(wěn)定的優(yōu)化體系，該體系中因子的最優(yōu)水平往往并非實驗所設(shè)計的，因此，該設(shè)計方法對統(tǒng)計學知識的應(yīng)用提出了更高的要求。

基于穩(wěn)定的RAPD反應(yīng)體系，本實驗將12個甜葉菊品種進行了親緣關(guān)系聚類。品種間的遺傳距離變異范圍為0.12～0.88，在遺傳距離為0.37時，可將12個品種分為四類，其中來自日本的甜葉菊品種與國內(nèi)的品種遺傳距離較遠，這種分析結(jié)果可為甜葉菊的系統(tǒng)育種和優(yōu)勢雜交育種工作提供重要的理論依據(jù)。

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Study on optimization of random amplified polymorphic DNA reaction system and genetic relationship in Stevia rebaudiana Bertoni

HU Neng-bing1，HE Ke-qin1，ZHANG Zi-xue1，LIN Ping1，SUI Yi-hu1，CUI Guang-rong1，2，*
（1.College of Plant Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China；2.Anhui Province Research and Technology Center of Stevia rebaudiana Bertoni，Bengbu 233000，China）

Optimization of 7 factors of random amplified polymorphic DNA（RAPD）reaction system and relationship analysis of 12 kinds of cultivars in Stevia rebaudiana Bertoni were studied.The results indicated that，optimization system of 20μL included：13.6μL of ddH2O，3μL of 10×Buffer with 15mmol/L MgCl2，1.2μL of 2.5mmol/L dNTPS，1μL of 10μmol/L Primer，1μL of 20ng DNA and 1unit of Taq polymerase；thermal cycle program was：1 cycle of denaturing for 4min at 94℃，40 cycles of denaturing for 30s at 94℃，annealing for 30s at 35℃，primer extension for 1 min at 72℃，and the last cycle of extension for 7min at 72℃.The result of clustering showed that the genetic distance among 12 cultivars ranged from 0.12 to 0.88，and could be classified into four groups when the genetic distance was 0.37，while two cultivars from Japan was far away from Chinese cultivars.

Stevia rebaudiana Bertoni；random amplified polymorphic DNA；optimization；genetic realtionship

TS201.1

A

1002-0306（2012）05-0159-05

2011-03-16 *通訊聯(lián)系人

胡能兵（1980-），男，在職博士，講師，主要從事園藝植物組織培養(yǎng)及育種工作。

安徽省教育廳省級重點自然科學基金項目（KJ2010A073）；蚌埠市科技計劃項目（科字051）。