陳建平，蘇健裕，陳 玲，李 琳，李 冰，李曉璽

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的抗氧化活性研究

陳建平，蘇健裕*，陳 玲，李 琳，李 冰，李曉璽

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

目的：對(duì)梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的抗氧化活性進(jìn)行了研究。 方法：采用水蒸氣蒸餾法提取得到揮發(fā)油，用紫外分光光度法測(cè)定揮發(fā)油對(duì)羥基（OH）自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除能力以及揮發(fā)油的還原能力，并與2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）比較。同時(shí)，對(duì)影響其抗氧化活性的物質(zhì)進(jìn)行分析。 結(jié)果：揮發(fā)油對(duì)羥基自由基具有較好的清除能力，且清除效果要強(qiáng)于BHT；而揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除率和還原能力要明顯弱于BHT，梅片樹(shù)葉揮發(fā)油中高含量的總多酚和總黃酮可能是其抗氧化活性的主要物質(zhì)來(lái)源。 結(jié)論：揮發(fā)油在某些抗氧化活性方面有較好的抗氧化效果，具有作為天然抗氧化劑的巨大潛力。

梅片樹(shù)，揮發(fā)油，抗氧化，水蒸氣蒸餾

梅片樹(shù)（Mei Pian tree）是樟科常綠喬木[1]，在外部形態(tài)方面與樟科樟屬的陰香（Cinnamomun burmannii B1.）無(wú)異，特點(diǎn)在于其葉含有豐富的右旋龍腦，故梅片樹(shù)應(yīng)是陰香的一個(gè)含右旋龍腦的生理類型，或稱化學(xué)類型。梅片樹(shù)多數(shù)在南亞熱帶常綠闊葉林中或林緣混生[2]。在我國(guó)，梅片樹(shù)主要分部在云南及廣東東部地區(qū)。細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生的損傷可以導(dǎo)致癌癥、心血管疾病和免疫系統(tǒng)衰退等多種退變性疾病[3]，攝入外源性的抗氧化劑能有效地預(yù)防或抑制這些疾病的發(fā)生。因此，天然抗氧化劑受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。近年來(lái)，揮發(fā)油的抗氧化活性研究成為熱點(diǎn)，如迭迷香精油[5]、鼠尾草精油[6]、香菜精油[7]、仙人掌精油[8]等。上世紀(jì)八十年代，中科院華南植物所在廣東梅州地區(qū)的樟科陰香化學(xué)型——梅片樹(shù)枝葉中提取得到了揮發(fā)油。然而，目前國(guó)內(nèi)梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的研究主要集中在揮發(fā)油的提取工藝及其成分分析等方面，暫無(wú)對(duì)梅片樹(shù)枝葉中揮發(fā)油抗氧化活性的相關(guān)研究報(bào)道。本文運(yùn)用水蒸氣蒸餾和抽濾得到梅片樹(shù)葉揮發(fā)油，通過(guò)紫外分光光度法對(duì)其清除羥基自由基和DPPH自由基的性能以及揮發(fā)油還原能力進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)影響其抗氧化活性的主要物質(zhì)進(jìn)行分析，從而探討梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的抗氧化性能，以期為產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)梅片樹(shù)、闡明梅片樹(shù)揮發(fā)油抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅片樹(shù)葉 廣東省梅州市廣東嘉應(yīng)制藥股份有限公司提供，中科院華南植物研究所鑒定為樟科陰香化學(xué)型（Cinnamomun burmannii B1.）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純；鐵氰化鉀、三氯乙酸 江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純；三氯化鐵 臺(tái)山市奧僑試劑塑料有限公司，分析純；30%過(guò)氧化氫 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；BS224S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；50-conc紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)VARIAN公司；3K30冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)SIGMR公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取[9]將新鮮梅片樹(shù)葉粉碎，按《中國(guó)藥典》（2005版）附錄XD的水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。收集蒸餾的餾出物，向其中投入過(guò)量無(wú)水硫酸鈉并充分振蕩，使用循環(huán)水式真空泵抽濾此混合物得到揮發(fā)油。揮發(fā)油為黃色透明油狀物，稱量、計(jì)算揮發(fā)油的得率。

揮發(fā)油得率（%）=[揮發(fā)油質(zhì)量（g）/梅片樹(shù)葉質(zhì)量（g）]×100%

1.2.2 揮發(fā)油成分分析[10]

1.2.2.1 GC條件 HP-5MS彈性石英毛細(xì)柱管（30m× 0.25mm，0.25μm）；升溫程序：80℃恒溫1min后，以20℃/min的速度升溫至250℃，保持5min。進(jìn)樣量0.5μL，采用不分流的方式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250℃；檢測(cè)溫度為300℃；載氣為氮?dú)?，過(guò)柱載氣恒流速為2mL/min。

1.2.2.2 MS條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度230℃；發(fā)射電流34.6VA，電子倍增器電壓1392V；掃描質(zhì)量范圍m/z 33～450。

1.2.3 揮發(fā)油的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 揮發(fā)油對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 取5支試管，依次加入1.5mmol/L的鄰二氮菲溶液1mL，磷酸鹽緩沖液PBS（pH7.4）2mL，揮發(fā)油各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，充分混勻，加入0.01%H2O21mL，在37℃下恒溫反應(yīng)45min，在536nm處測(cè)其吸光度，其吸光值稱為As。同前步，用1mL蒸餾水代替H2O2，測(cè)得的吸光度稱為Ab。用蒸餾水1mL代替1mL溶液，測(cè)得的吸光度稱為Ap，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作比較。所有測(cè)定平行進(jìn)行三次。OH自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.2.3.2 揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定 取不同濃度的揮發(fā)油（0.02、0.1、0.2、0.5mg/mL）各2mL，分別添加0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液各2mL，混合物用力振蕩并室溫避光反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)吸光值A(chǔ)i，同時(shí)測(cè)定DPPH乙醇溶液2mL+乙醇2mL的吸光度Ao和溶液2mL+乙醇2mL的吸光度Aj，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作比較。所有測(cè)定平行進(jìn)行三次。計(jì)算公式如下：

DPPH·抑制率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100%[15]

1.2.3.3 揮發(fā)油的還原能力測(cè)定 取不同濃度的揮發(fā)油溶液（0.2、0.4、1.0mg/mL）各2.5mL，加入0.2mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH=6.6）2.5mL和2.5mL的1%的鐵氰化鉀，混合物在50℃的水浴中保溫20min，再加入2.5mL的10%的三氯乙酸，在200×g下離心10min。取上清液3.5mL與0.5mL去離子水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵混合，最后，在700nm處測(cè)其吸光度，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）做對(duì)照。所有測(cè)定平行進(jìn)行三次。

1.2.3.4 揮發(fā)油中總黃酮含量的測(cè)定 采用Meda等[11]的方法，略有修改。取5mL揮發(fā)油，加入5mL 2%AlCl3溶液。另取揮發(fā)油5mL，加入5mL 2%乙醇溶液作為空白實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)10min后在415nm處測(cè)定其吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品配成一定質(zhì)量濃度的樣液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有測(cè)定平行進(jìn)行三次。所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

式中：A：吸光度；C1：蘆丁的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.2.3.5 揮發(fā)油中總多酚含量的測(cè)定 采用Slinkard等[12]的方法，略有修改。取0.5mL的揮發(fā)油，依次加入1mL 0.2mol/L福林試劑、3mL 2%Na2CO3溶液和45mL蒸餾水，室溫振蕩反應(yīng)2h，在760nm處測(cè)定其吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)樣，配成一定質(zhì)量濃度的樣液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有測(cè)定平行進(jìn)行三次。根據(jù)測(cè)得的吸光度，計(jì)算樣品中的多酚含量（以沒(méi)食子酸計(jì)）。所得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

式中：A：吸光度；C2：沒(méi)食子酸的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油的成分分析

采用水蒸氣蒸餾法提取梅片樹(shù)葉中揮發(fā)油，并且利用GC-MS分析揮發(fā)油的組成，其主要成分見(jiàn)表1。

表1 梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的主要成分[10]Table 1 The main composition of volatile oil from Mei Pian tree

2.2 揮發(fā)油的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 揮發(fā)油對(duì)羥基自由基的清除能力 鄰二氮菲-Fe2+是常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變。H2O2/Fe2+體系通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基[13]，鄰二氮菲-Fe2+水溶液可被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+，從而使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失。當(dāng)反應(yīng)體系中存在羥基自由基清除劑時(shí)，就可以抑制羥基自由基的形成，從而使得鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰不會(huì)完全消失，根據(jù)536nm處吸光度的變化，可以推知樣品對(duì)羥基自由基的抑制率。

梅片樹(shù)葉揮發(fā)油和BHT對(duì)羥基自由基清除率的結(jié)果如表2所示，可知揮發(fā)油和BHT對(duì)羥基自由基都有一定的清除作用。在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的體積范圍內(nèi)，揮發(fā)油和BHT對(duì)羥基自由基的清除率均隨著其體積的增加而增大，基本呈線性關(guān)系。從表2可知，在一定的體積范圍內(nèi)（0.6～1.0mL），揮發(fā)油對(duì)羥基自由基的清除能力要強(qiáng)于BHT。當(dāng)揮發(fā)油的體積為1mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除能力達(dá)到最大（95.37%），遠(yuǎn)大于1mL BHT對(duì)羥基自由基的清除能力（52.24%）。這可能是因?yàn)轶w積的增大，揮發(fā)油中抗氧化物質(zhì)增多，對(duì)羥基自由基的清除能力增強(qiáng)。

表2 相同濃度不同體積的揮發(fā)油和BHT對(duì)羥基自由基的清除率Table 2 The different volume of the same concentration of volatile oil and BHT on activity of scavenging OH radicals

2.2.2 揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除能力 DPPH·在有機(jī)溶劑中由于苯環(huán)的共軛和位阻及硝基的吸電子作用而形成，是一種比較穩(wěn)定的自由基[14]，其N上有一個(gè)游離電子，其乙醇溶液呈紫色，在517nm處有最大吸收峰。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系[15]。依此原理用分光光度計(jì)檢測(cè)DPPH自由基與試樣液反應(yīng)后吸光值的變化，可檢定樣品提供氫原子、清除自由基抗氧化的能力。

根據(jù)表3可知，揮發(fā)油和BHT對(duì)DPPH·的清除能力在不同濃度下強(qiáng)弱不同。在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的濃度范圍（0.02～0.5mg·mL-1）內(nèi)，揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除能力要明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照BHT。隨著揮發(fā)油濃度的提高，其對(duì)DPPH·的抑制率總體呈上升趨勢(shì)。可能是由于揮發(fā)油濃度的提高，揮發(fā)油中抗氧化活性物質(zhì)含量增多，從而使得揮發(fā)油對(duì)DPPH·的抑制率也有所上升。

表3 梅片樹(shù)葉揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除率Table 3 Scavenging effect on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl of essential oil from Mei Pian tree at different concentrations

2.2.3 揮發(fā)油的還原能力測(cè)定 三價(jià)鐵離子被樣品還原為二價(jià)鐵離子，二價(jià)鐵離子與鐵氰化鉀反應(yīng)生成對(duì)可見(jiàn)光有較強(qiáng)吸收的普魯士藍(lán)[16]，通過(guò)測(cè)定普魯士藍(lán)的吸光度來(lái)間接判定樣品的還原能力。

不同濃度揮發(fā)油和陽(yáng)性對(duì)照BHT的還原能力如表4所示，可知揮發(fā)油隨其濃度的上升，其還原能力也隨之增強(qiáng)。這也許是揮發(fā)油中具有還原能力的物質(zhì)增加，使得更多的鐵離子還原成為亞鐵離子，因此吸光度值上升。當(dāng)揮發(fā)油濃度為1.0mg·mL-1時(shí)，吸光度值為0.4492。從表4可知，相同濃度的揮發(fā)油的還原能力要明顯弱于BHT。

表4 不同濃度的揮發(fā)油和BHT的還原能力Table 4 The reductive ability of different concentration of volatile oil and BHT

2.2.4 揮發(fā)油中總黃酮和總多酚含量的測(cè)定 為了進(jìn)一步探討梅片樹(shù)葉揮發(fā)油抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)揮發(fā)油中總黃酮和總多酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果如表5所示。從表5可知，揮發(fā)油中總多酚和總黃酮的含量分別達(dá)到了（124.95±2.70）μg/mg和（2.7384±0.01）μg/mg，從而說(shuō)明影響揮發(fā)油抗氧化活性的物質(zhì)可能主要來(lái)自高含量的總多酚和總黃酮。江慎華[17]等人對(duì)丁香的抗氧化活性進(jìn)行研究時(shí)，也發(fā)現(xiàn)其主要的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)由總多酚和總黃酮所貢獻(xiàn)。由此可見(jiàn)，梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的抗氧化活性可能主要來(lái)自總多酚和總黃酮的假設(shè)得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表5 梅片樹(shù)葉揮發(fā)油中總黃酮和總多酚含量Table 5 Total phenolics and flavonoids content of essential oil from leaves of Mei Pian tree

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)羥基自由基的清除能力、DPPH·清除能力和揮發(fā)油還原能力三方面來(lái)評(píng)價(jià)梅片樹(shù)葉揮發(fā)油的抗氧化活性，并與陽(yáng)性對(duì)照品BHT作比較。通過(guò)GC-MS分析影響揮發(fā)油的主要成分，并且測(cè)定了揮發(fā)油中總黃酮和總多酚的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在一定的體積范圍內(nèi)，揮發(fā)油對(duì)羥基自由基清除能力要強(qiáng)于BHT，說(shuō)明揮發(fā)油對(duì)羥基自由基具有較好的清除能力，能有效清除羥基自由基。盡管揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除率和還原能力均不如BHT，但考慮到揮發(fā)油是混合物，其中所含的雜質(zhì)比較多，而陽(yáng)性對(duì)照為高濃度的分析純，如果進(jìn)一步提高揮發(fā)油中活性物質(zhì)的濃度，其抗氧化效果將會(huì)有明顯的提高。經(jīng)過(guò)GC-MS分析測(cè)定，揮發(fā)油的抗氧化活性由其主要成分決定，且揮發(fā)油中高含量的總多酚和總黃酮可能是其抗氧化活性的主要物質(zhì)來(lái)源。

雖然上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人工合成抗氧化劑BHT也具有良好的抗氧化效果，但作為化學(xué)合成抗氧化劑，其使用劑量有嚴(yán)格限制[18]。然而，相比化學(xué)合成抗氧化劑而言，天然的梅片樹(shù)葉揮發(fā)油具有毒副作用小、可使用劑量無(wú)嚴(yán)格限制等優(yōu)點(diǎn)，且在某些抗氧化活性上也明顯優(yōu)于人工合成的抗氧化劑，因此，梅片樹(shù)葉揮發(fā)油具有作為天然抗氧化劑的巨大潛力，這為開(kāi)發(fā)新的天然無(wú)害抗氧化劑提供了新的思路和資源。同時(shí)，在食品保鮮、藥物研發(fā)等方面，梅片樹(shù)葉揮發(fā)油也具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on antioxidant activity of volatile oil from Mei Pian tree

CHEN Jian-ping，SU Jian-yu*，CHEN Ling，LI Lin，LI Bing，LI Xiao-xi
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The antioxidant activity of volatile oil from Mei Pian tree（Cinnamomun burmannii physilogical type）was studied.The volatile oil was extracted by the methods of steam distillation.The antioxidant activity of volatile oil was evaluated by the methods of spectrophotometry，and the antioxidant activities were compared with BHT.The results showed that the activity of scavenging·OH radicals of volatile oil was stronger than BHT. The activity of scavenging DPPH·radicals and reduce power of volatile oil were weaker than BHT.And the antioxidant activity of volatile oil from Mei Pian tree mainly resulted from the high contents of total phenols and total flavonoids of volatile oil.Therefore，the volatile oil obtained from Mei Pian tree was proved to have strong antioxidant activity.

Mei Pian tree（Cinnamomun burmannii physilogical type）；volatile oil；antioxidant activity；steam distillation

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0149-04

2011－03－22 *通訊聯(lián)系人

陳建平（1986-），男，碩士研究生，研究方向：糖類物質(zhì)及其藥物制備與生物利用。

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目（10451064101005160）；廣東省教育部科技部企業(yè)科技特派員行動(dòng)計(jì)劃專項(xiàng)項(xiàng)目（2009B090600055）；省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2009A090100041，2010B090500033）。