宮國(guó)君，朱蓓薇，楊靜峰，米云龍

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

皺紋盤鮑內(nèi)臟β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶學(xué)性質(zhì)研究

宮國(guó)君，朱蓓薇，楊靜峰*，米云龍

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

從鮑魚(yú)內(nèi)臟提取β-1，3-葡聚糖酶粗酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)。以昆布多糖為底物監(jiān)控酶的活性。鮑魚(yú)內(nèi)臟經(jīng)勻漿后，采用3倍體積0.1mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0）浸提12h。浸提液經(jīng)離心后收集上清液，并采用60%飽和度的硫酸銨對(duì)上清液中的蛋白進(jìn)行鹽析沉淀得β-1，3-葡聚糖酶粗酶。研究表明，粗酶中β-1，3-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，酶活力在40℃以下穩(wěn)定；酶的最適pH為6.0，酶活力在pH4.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。Mn2+能明顯激活酶活力，而Cu2+、Fe3+、Hg+對(duì)酶活力有抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最強(qiáng)；亮肽酶素和1，10-菲啰啉對(duì)酶活力有明顯的抑制作用，而E-64對(duì)酶活力有一定的激活作用；此酶對(duì)海藻酸鈉也有一定水解能力。

鮑魚(yú)，β-1，3-葡聚糖酶，酶學(xué)性質(zhì)

β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39）是一類能夠特異性水解β-1，3糖苷鍵的水解酶。可用于飼料及啤酒工業(yè)[1-2]、增加多糖溶解性[3]、制備酵母原生質(zhì)體[4]、植物病害防治等方面[5]。該酶廣泛存在于微生物，如真菌[6]、細(xì)菌[7]、放線菌[8]等，植物如小麥[9]、青稞[10]、天麻[11]等和動(dòng)物中。海洋中β-1，3-葡聚糖酶主要分布于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物。趙軍崗等已從海參腸道中提取分離出此酶[12]，BACHMAN E S等對(duì)海參（Strongylocentrotus purpuratus）卵中的β-1，3-葡聚糖酶分子量等性質(zhì)進(jìn)行了研究[13]。另外Svetlana N等從扇貝（Mizuhopecten yessoensi）分離純化出β-1，3-葡聚糖酶并研究了該酶基因的克隆與表達(dá)[14]。同樣是海洋動(dòng)物的鮑魚(yú)是一種海洋單殼軟體貝類，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值[15]。已有報(bào)道從鮑魚(yú)體內(nèi)提取分離褐藻膠裂解酶、淀粉酶及纖維素酶等消化酶[16-18]，而從鮑魚(yú)的體內(nèi)提取消化酶中的另一重要組成的β-1，3-葡聚糖酶，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以鮑魚(yú)內(nèi)臟為材料提取了鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖酶，并對(duì)其粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究和探討，對(duì)于了解鮑魚(yú)生理消化特性具有十分重要的意義，并為該酶的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑魚(yú)內(nèi)臟 由大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)提供；昆布多糖Laminarin、牛血清蛋白BSA、直鏈淀粉Amylose、支鏈淀粉Amylopectin Sigma公司；其他化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；Z323K冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle labortechnik。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶的制備 稱取20g的鮑魚(yú)內(nèi)臟加入3倍體積單位的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0，0.1mol/L），4℃下進(jìn)行勻漿，低溫靜置12h后，冷凍離心（12000r/min，4℃）20min，上清液即為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活力測(cè)定 β-1，3-葡聚糖酶酶活力測(cè)定參照Wang等人[19]報(bào)道的方法，并略作改進(jìn)稱取8mg底物，加入10mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0，0.1mol/L）配成質(zhì)量濃度為0.8mg/mL的底物儲(chǔ)備液。取上述底物0.4mL，加入0.1mL酶液，于一定溫度下反應(yīng)30min，再加入0.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，于沸水浴顯色反應(yīng)5min，冷卻后加入4mL蒸餾水稀釋，540nm測(cè)定吸光光度值，以100℃水浴加熱5min的酶液作為空白。酶活力單位（U）定義：在上述反應(yīng)條件下，以每分鐘水解底物釋放出1μg還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Lowry[20]法，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.4 適宜硫酸銨飽和度的確定 取8份100mL的粗酶液，邊攪拌邊加入硫酸銨，使其飽和度分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃靜置12h，冷凍離心（12000r/min，4℃）10min，棄上清液，所得沉淀溶于10mL的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH6.0，0.1mol/L）中，同時(shí)測(cè)定上清液和沉淀中蛋白質(zhì)含量及酶活力。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)的研究 最適反應(yīng)pH的確定，分別用不同pH3.0～11.0的緩沖液配制成0.8mg/mL的底物然后加入酶液反應(yīng)，測(cè)定酶活力。酸堿穩(wěn)定性的確定，將酶液加入pH3.0～10.0的緩沖液，于4℃保持30min后，測(cè)定酶活力。最適反應(yīng)溫度的確定，酶液與底物溶液混合后，分別于10、20、30、40、50、60、70、80℃反應(yīng)30min，反應(yīng)前底物在各反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min，測(cè)定酶活力。金屬離子對(duì)酶活力的影響，在酶與底物反應(yīng)體系中，分別加入Fe3＋、Hg＋、Ni＋、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+、K+，使其終濃度為1mmol/L，以不加金屬離子的酶活作為100%，測(cè)定酶活力。抑制劑對(duì)酶活力的影響，在酶與底物反應(yīng)體系中，分別加入亮肽酶素、PMSF、EDTA、E-64、DTT、碘乙酸、1，10-啡啰啉和抗痛素使其終濃度為0.1mmol/L，以不加抑制劑的酶活作為100%，測(cè)定酶活力。底物特異性的研究，分別配制0.8mg/mL的羧甲基纖維素鈉、褐藻酸鈉、直鏈淀粉、支鏈淀粉和昆布多糖，加入一定量的酶液反應(yīng)，測(cè)定酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖酶的提取

鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖酶的提取率約為84.5%，即20g鮑魚(yú)內(nèi)臟能提取出16.89g的β-1，3-葡聚糖粗酶，酶總活力為246.97U。

2.2 硫酸銨飽和度對(duì)提取效果的影響

硫酸銨飽和度對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶活力的影響見(jiàn)圖1。隨著硫酸銨飽和度的增加，上清液中酶活力隨著硫酸銨飽和度的增加逐漸降低，當(dāng)飽和度達(dá)到80%時(shí)，上清液中酶活力為0。沉淀中β-1，3-葡聚糖酶活力均逐漸增加，當(dāng)飽和度達(dá)到60%時(shí)酶收率最大，但當(dāng)硫酸銨飽和度超過(guò)60%時(shí)，沉淀中酶活力反而下降，這主要是由于高飽和度的硫酸銨使酶蛋白部分失活造成[21]。因此，確定鹽析提取β-1，3-葡聚糖酶的飽和度最優(yōu)條件為60%。

圖1 β-1，3-葡聚糖酶硫酸銨鹽析圖Fig.1 Salting out figure of β-1，3-glucanase

2.3 最適pH的確定

由圖2可知，鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶在pH4.0～ 7.0范圍內(nèi)相對(duì)酶活力較高，當(dāng)pH為6.0時(shí)相對(duì)酶活力最高，當(dāng)pH大于6.0時(shí)，隨著緩沖液pH的升高，相對(duì)酶活力逐漸降低，當(dāng)pH大于10.0時(shí)，相對(duì)酶活力降到50%以下。該結(jié)果與Ana-Belén等研究來(lái)源于S.cerevisiae的β-1，3-葡聚糖酶，最適pH為6.0相一致[22]，但高于扇貝Mizuhopecten yessoensis中的β-1，3-葡聚糖酶的最適pH4.5[14]，說(shuō)明該酶的最適pH與物種差異性有關(guān)。

圖2 β-1，3-葡聚糖酶的最適pHFig.2 Profile of pH-dependent of β-1，3-glucanase

2.4 酸堿穩(wěn)定性的確定

由圖3可知，鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶在pH4.0～7.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，當(dāng)酶處于pH3.0和pH9.0的環(huán)境中時(shí)，相對(duì)酶活力分別降低到40.73%和32.85%，說(shuō)明鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶的穩(wěn)定性與酶的最適pH的范圍相符。有研究表明鮑魚(yú)體內(nèi)多種消化酶都在pH4.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定[16，23-24]。

圖3 pH對(duì)β-1，3-葡聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Stability of pH-dependent of β-1，3-glucanase

2.5 最適溫度的確定

由圖4可知，鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶在30～ 50℃范圍內(nèi)酶活力較高，相對(duì)酶活力均在80%以上，其最適反應(yīng)溫度為40℃，大于50℃時(shí)酶活力開(kāi)始下降，至70℃時(shí)相對(duì)酶活力降低到50%以下。鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶在較寬的溫度范圍內(nèi)都有一定酶活力，這一性質(zhì)將有利于酶的應(yīng)用，特別是在細(xì)胞自溶和啤酒發(fā)酵中[25-26]。

圖4 β-1，3-葡聚糖酶的最適溫度Fig.4 Profile of temperature-dependent of β-1，3-glucanase

2.6 金屬離子對(duì)酶活力的影響

表1 金屬離子對(duì)β-1，3-葡聚糖酶活力的影響Table 1 Effect of differet metl ions on β-1，3-glucanase

由表1可知，10mmol/L和1mmol/L兩個(gè)離子濃度下Cu2+、Mg2+、Zn2+、Hg+、Fe3+和Ni+對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶有抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最強(qiáng)，Cu2+其次。Fe2+、Ba2+和K+對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶酶活力影響不大。10mmol/L和1mmol/L的Mn2+均對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶有激活作用，相對(duì)酶活力分別為276.5%和176.1%。金屬離子對(duì)β-1，3-葡聚糖酶酶活力的影響，因酶的來(lái)源不同而存在差異。來(lái)源于木霉菌株LE02的β-1，3-葡聚糖酶被Mn2+強(qiáng)烈抑制[27]，而Mn2+卻能激活來(lái)源于海參的β-1，3-葡聚糖酶[12]。吳琪等人研究發(fā)現(xiàn)Fe3+對(duì)β-葡聚糖酶活力的影響不大，而唐治玉等人研究發(fā)現(xiàn)Fe3+對(duì)里氏木霉所產(chǎn)生的β-葡聚糖酶有強(qiáng)烈的抑制作用[27]。

2.7 抑制劑對(duì)酶活力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所選擇的抑制劑，即PMSF、EDTA、1，10-啡啰啉、E-64和亮肽酶素，其中只有E-64對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶有激活作用，相對(duì)酶活力達(dá)164.02%，EDTA、亮肽酶素和1，10-啡啰啉對(duì)酶的抑制作用不明顯，相對(duì)酶活力分別為95.37%、86.29%和88.86%。巰基抑制劑E-64對(duì)該酶無(wú)抑制作用反而能增加酶活力，可能是由于E-64抑制了酶液中的蛋白酶類（這些含巰基蛋白酶類會(huì)占據(jù)底物的結(jié)合位點(diǎn)，阻礙β-1，3-葡聚糖酶與底物結(jié)合），進(jìn)而間接地激活了β-1，3-葡聚糖酶[28]。

2.8 底物特異性的研究

由表2可知，鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶對(duì)昆布多糖的水解能力最強(qiáng)，比活力可達(dá)1.85U/mg。該酶同時(shí)對(duì)褐藻酸鈉支鏈淀粉有一定水解能力，但是對(duì)羧甲基纖維素鈉和直鏈淀粉幾乎不能降解。這說(shuō)明該酶對(duì)β-1，3糖苷鍵有很強(qiáng)的專一性，同時(shí)對(duì)α-1，4糖苷鍵也有一定水解作用。鮑魚(yú)主要以海帶為食，而其中的能量物質(zhì)即為β-1，3糖苷鍵連接的多糖，所以說(shuō)鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖酶是鮑魚(yú)能量代謝中的重要酶類之一[29]。

表2 β-1，3-葡聚糖酶的底物特異性Tab 2 Substrate specificity of β-1，3-glucanase

3 結(jié)論

用pH6.0，0.1mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液提取的鮑魚(yú)內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖粗酶，最佳提取條件：60%硫酸銨鹽析，其最適反應(yīng)溫度為40℃，酶的最適pH為6.0，酶活力在pH4.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。Mn2+能明顯激活酶活力，而Cu2+、Fe3+、Hg+對(duì)酶活力有抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最強(qiáng)。亮肽酶素和1，10-菲啰啉對(duì)酶活力有明顯的抑制作用，而E-64對(duì)酶活力有一定的激活作用，此酶對(duì)β-1，3糖苷鍵有很強(qiáng)的專一性。

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Extraction and properties of β-1，3-glucanase from viscera of the abalone Haliotis discus hannai

GONG Guo-jun，ZHU Bei-wei，YANG Jing-feng*，MI Yun-long
（School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Extraction and partial properties of crude β-1，3-glucanase from viscera of the abalone Haliotis discus hannai were investigated.In the course of research，laminarin was used as a specific substrate to monitor the enzyme activity.Fresh abalone viscera were homogenized and mixed with three times volume of phosphate and citric acid buffer（pH6.0，0.1mol/L）.Following extraction for 12h，the mixture was centrifuged. Proteins in the supernatant were precipitated with ammonium sulfate at the concentration of 60%saturation to get crude β-1，3-glucanase.The optimum activity temperature and pH of the crude enzyme were 40℃ and pH6.0.The enzyme activity appeared to be stable over pH4.0～7.0 and up to 40℃.The enzyme activity was activated significantly by Mn2+，Cu2+，F(xiàn)e3+and Hg+could inhibit the enzyme activity，in which Fe3+was the strongest inhibitor.Leupeptin and 1，10-phenanthroline could inhibit the enzyme activity，but E-64 could enhance the enzyme activity.

abalone；β-1，3-glucanase；enzymatic properties

TS254.1

A

1002-0306（2012）03-0110-04

2010－12－28 *通訊聯(lián)系人

宮國(guó)君（1984-），女，碩士研究生，研究方向：海洋生物化學(xué)與微生物學(xué)。

國(guó)家863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2007AA091804）；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2008BAD94B07）。