馬立然，黃 亮，2，*，李安平，2，謝碧霞

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004；2.糧油深加工及品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004）

超聲波輔助雙水相體系提取橡實(shí)仁多酚的研究

馬立然1，黃 亮1，2，*，李安平1，2，謝碧霞1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004；2.糧油深加工及品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004）

采用超聲波輔助雙水相體系提取橡實(shí)仁多酚，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率有顯著影響，硫酸銨用量、超聲時(shí)間、料液比在考察的范圍內(nèi)對(duì)多酚得率影響不顯著；橡實(shí)仁多酚的最佳提取條件為：丙酮體積分?jǐn)?shù)80%，硫酸銨用量0.16g/mL，超聲時(shí)間25min，料液比（W/V）1∶45；在此條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到橡實(shí)仁多酚的平均得率為3.3033mg/g，RSD為0.7674%，表明提取結(jié)果穩(wěn)定性極好。

雙水相體系，超聲提取，橡實(shí)仁，多酚

橡實(shí)是泛指除大量栽培種植板栗以外的殼斗科Fagaceae植物種子的總稱[1]。殼斗科植物一般為落葉或常綠喬木，鮮為灌木。我國(guó)是世界橡子的主要產(chǎn)地之一[2]。橡實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，淀粉含量一般在50%以上，蛋白質(zhì)、脂肪、VB含量都高于五谷，果仁碾制成的橡子粉是純綠色食品[3]。橡實(shí)殼和橡實(shí)仁均含有多酚類物質(zhì)[4-5]，具有抗氧化[6]、抑菌、抗動(dòng)脈硬化、抗癌變和防治心腦血管疾病[7]等功效，已經(jīng)得到越來(lái)越多人的關(guān)注和研究。傳統(tǒng)的提取方法如溶劑浸提法，不僅提取不完全，耗時(shí)，而且溶劑浪費(fèi)嚴(yán)重。超聲波提取法具有空化效應(yīng)、粉碎作用，對(duì)植物細(xì)胞有破壞現(xiàn)象，能使所提取物質(zhì)很好地溶于溶劑中，具有提取時(shí)間短，產(chǎn)率高，無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)[8]。雙水相萃取分離技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)，因其分離條件溫和、成相時(shí)間短、適合大規(guī)模操作、生物親和性好等優(yōu)點(diǎn)[9]已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品化工、重金屬離子、植物有效成分的分離[10-12]。本文采用超聲波輔助丙酮-硫酸銨雙水相體系提取分離橡實(shí)仁中多酚，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橡實(shí) 大葉青岡，采自湖南衡山，于40℃干燥箱中干燥并粉碎通過(guò)100目篩；沒(méi)食子酸、磷酸氫二鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀 天津市博迪化工有限公司；酒石酸鉀鈉 湘中化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵 廣東省臺(tái)山市化工廠；硫酸銨 天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙酮 湖南匯虹試劑有限公司；無(wú)水乙醇 安徽安特生物化學(xué)有限公司；以上試劑均為分析純。

101-型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；FZ101微型植物試樣粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；AR1140電子分析天平 奧豪斯（上海）公司；R201D-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；5510E-DTH超聲波清洗器 美國(guó)必能信公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚含量的測(cè)定 采用酒石酸亞鐵法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取50mg沒(méi)食子酸，用蒸餾水溶解，定容至100mL，搖勻，制備成0.5mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL容量瓶中，加蒸餾水至5mL和酒石酸亞鐵溶液5mL，充分混合，再加pH7.5磷酸鹽緩沖液至刻度，靜置15min，以試劑空白溶液作參比，在540nm處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=18.449x-0.0211，R2=0.9988（圖1）。式中：y-吸光度，x-沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度，mg/mL。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

1.2.3 丙酮-硫酸銨雙水相體系 丙酮-硫酸銨形成雙水相體系參照文獻(xiàn)[13-14]。在丙酮中加入硫酸銨，通過(guò)改變丙酮體積分?jǐn)?shù)和鹽的用量來(lái)控制雙水相的形成。

1.2.4 橡實(shí)仁中多酚的提取與含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.0g橡實(shí)仁粉末于具塞錐形瓶中，加入一定量的丙酮溶液和硫酸銨形成雙水相體系，浸泡30min，超聲提取一定時(shí)間，趁熱真空抽濾，濾液于分液漏斗中靜置分層，上層丙酮相用30%乙醇定容至100mL，按照1.2.2的方法在540nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算多酚得率。

式中：C-多酚質(zhì)量濃度（mg/mL），V-提取液的體積（mL），M-樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 丙酮體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨用量的選擇 固定料液比1∶30（g/mL），超聲時(shí)間15min，分別在丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%，不同硫酸銨用量的條件下提取，測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚得率。

1.2.5.2 超聲時(shí)間的選擇 固定料液比1∶30（g/mL），丙酮體積分?jǐn)?shù)70%，硫酸銨用量0.16g/mL，分別在超聲時(shí)間為5、10、15、20、25、30min的條件下提取，測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚得率。

1.2.5.3 料液比的選擇 固定超聲時(shí)間25min，丙酮體積分?jǐn)?shù)70%，硫酸銨用量0.16g/mL，分別在料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50的條件下提取，測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚得率。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇丙酮體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨用量、超聲時(shí)間、料液比為考察因素，采用四因素三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表如表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 橡實(shí)仁多酚提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 丙酮體積分?jǐn)?shù)與硫酸銨用量對(duì)多酚得率的影響 由圖2可以看出，不同丙酮體積分?jǐn)?shù)的雙水相體系，隨著硫酸銨用量的增加，多酚得率增加，當(dāng)加入的硫酸銨達(dá)到一定量時(shí)，多酚得率開(kāi)始下降。當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值硫酸銨用量分別為0.22、0.18、0.16g/mL，此時(shí)，多酚得率分別為2.3856、2.4127、2.4344mg/g。

物質(zhì)在雙水相體系中的萃取分離行為受分配定律支配。在丙酮-硫酸銨形成的雙水相體系中，上相富含丙酮，下相富含無(wú)機(jī)鹽，橡實(shí)仁多酚易溶于有機(jī)溶劑，根據(jù)相似相溶原理，多酚進(jìn)入富含丙酮的上相中。雙水相的形成是一個(gè)丙酮與硫酸銨爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程。當(dāng)加入的丙酮量小時(shí)，分相所需硫酸銨的量較大。隨著硫酸銨濃度進(jìn)一步增加，鹽對(duì)水的束縛能力增強(qiáng)，奪取了水分子，丙酮被釋放出來(lái)，從而使上相中丙酮的體積分?jǐn)?shù)增加，下相中丙酮的體積分?jǐn)?shù)減少，進(jìn)而影響到上相的極性，必然影響到多酚在上相中的分配。由圖2可知，選取丙酮體積分?jǐn)?shù)為70%，硫酸銨用量為0.16g/mL為最佳提取條件。

圖2 不同丙酮體積分?jǐn)?shù)和（NH4）2SO4用量對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effect of amount of（NH4）2SO4on the yield of polyphenols in different acetone concentration

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 由圖3可以看出：多酚得率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大，這是因?yàn)槌晻r(shí)間延長(zhǎng)，可以使多酚充分地溶解到丙酮相中。達(dá)到25min時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明多酚已溶解完全，超過(guò)25min后多酚得率下降，可能是由于多酚的不穩(wěn)定性，在氧氣和光照條件下發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)導(dǎo)致多酚得率下降。因此，提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，選擇25min為最適宜超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effect of length of extraction time on the yield of polyphenols

2.1.3 料液比對(duì)多酚得率的影響 由圖4可以看出：隨著料液比的增加，多酚得率逐漸上升，在料液比1∶40時(shí)達(dá)到最大值，隨后下降?？赡苁怯捎陔S著料液比的增加，其他可以溶于丙酮的成分溶出，影響到了測(cè)定結(jié)果。同時(shí)，料液比過(guò)大造成溶劑的浪費(fèi)，也給后續(xù)的濃縮純化等工作帶來(lái)困難。因此選擇料液比1∶40為最佳提取料液比。

圖4 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝的結(jié)果與分析

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析得到的數(shù)據(jù)，通過(guò)極差和方差分析確定橡實(shí)仁多酚的最佳提取條件，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表3 橡實(shí)仁多酚正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiment for polyphenols of acorn seed

由表2和表3可以看出，極差R值：RA＞RC＞RD＞RB，影響橡實(shí)仁多酚得率因素主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率影響最大，超聲提取時(shí)間次之，其次是料液比，硫酸銨用量對(duì)多酚得率影響最小；丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率有顯著性差異，其他因素在考察范圍內(nèi)影響較小。

綜合極差分析和方差分析得出，橡實(shí)仁多酚提取的最佳工藝組合是A3B2C2D3，即丙酮體積分?jǐn)?shù)80%、硫酸銨用量0.16g/mL，超聲時(shí)間25min，料液比（W/V）1∶45，橡實(shí)仁多酚得率為3.3033mg/g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)所得出結(jié)果的可靠性，采用上述最佳提取條件A3B2C2D3進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，做三次平行，多酚得率分別為3.2799、3.3015、3.3286mg/g，多酚平均得率為3.3033mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（Relative Standard Deviation）為0.7674%，表明優(yōu)化得到的最佳提取工藝參數(shù)可靠和準(zhǔn)確，具有可行性和參考應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)考察了丙酮體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨用量、超聲時(shí)間、料液比對(duì)多酚得率的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理可知，丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響有顯著性差異，其他因素在考察的范圍內(nèi)對(duì)多酚得率影響較小。各因素對(duì)多酚得率的影響主次順序?yàn)楸w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞料液比＞硫酸銨用量。

3.2 超聲波輔助雙水相體系提取橡實(shí)仁多酚的最佳工藝條件為：丙酮體積分?jǐn)?shù)80%，硫酸銨用量0.16g/mL，超聲時(shí)間25min，料液比（W/V）1∶45，在此條件下橡實(shí)仁多酚的平均得率為3.3033mg/g。

3.3 本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助雙水相體系提取多酚，可縮短提取時(shí)間，提取效果好，提取率高，條件溫和，可以獲得高活性的生物活性物質(zhì)。并且多酚在丙酮-硫酸銨雙水相體系中分配于丙酮相中，其他水溶性雜質(zhì)等則分配于鹽水相中，在提取的同時(shí)達(dá)到了多酚與雜質(zhì)的分離，有效地提高了純度。因此，在天然產(chǎn)物活性成分的提取分離領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

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Study on the extraction of polyphenols from acorn seed using ultrasound-assisted two-phase aqueous system

MA Li-ran1，HUANG Liang1，2，*，LI An-ping1，2，XIE Bi-xia1
（1.College of Food Science and Energy，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Deeply Processing and Quality Control of Cereals and Oils，Changsha 410004，China）

Polyphenols from acorn seed was extracted by ultrasound-assisted two-phase aqueous system and through one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods to optimize extracting condition.The results indicated that acetone concentration had significant influence on the yield of polyphenols，the influence of amount of（NH4）2SO4and ultrasonic time and material-solvent ratio on the yield of polyphenols wasn't significant under the test range.The optimum conditions for the extraction of polyphenols were as follows，acetone concentration 80%，amount of（NH4）2SO40.16g/mL，ultrasonic time 25min，material-solvent ratio 1∶45（W/V）. Under the optimum conditions，through duplicated experiment the yield of polyphenols was 3.3033mg，RSD was 0.7674%，it indicated that the extraction rate of polyphenols was extremely stable.

two-phase aqueous system；ultrasonic extraction；acorn seed；polyphenols

TS201.2

B

1002-0306（2012）03-0191-04

2011－05－03 *通訊聯(lián)系人

馬立然（1983-），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

國(guó)家林業(yè)科技公益項(xiàng)目（200804033）。