趙躍平，燕平梅，邢 勇，張小冰，王小麗

（太原師范學院生物系，山西 太原 030031）

種質(zhì)資源是人類極其珍貴的財富。隨著經(jīng)濟發(fā)展，地球不斷開發(fā)及生態(tài)環(huán)境破壞，每年都有多個物種消失或瀕臨滅絕。各種植物，包括栽培種、野生種甚至雜草，都具有各自獨特的優(yōu)良基因，是植物品種改良乃至農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎。它們是經(jīng)過長期進化而來，一旦失去不會再生。因此，世界各國都很重視植物種質(zhì)資源的收集與保存的研究。

全世界擁有的作物種質(zhì)資源96%以上是以種子形式保存的。溫度是影響種子新陳代謝的主要因素之一，在低溫狀態(tài)下，種子細胞內(nèi)代謝活動水平很低，物質(zhì)和能量消耗少，細胞的衰老進程也很緩慢，因而可以長期保持種子生活力。國內(nèi)外研究證明,利用液氮（-196℃）超低溫冷凍技術可安全保存許多植物的種子、花粉、分生組織、芽、愈傷組織和細胞等[1]。超低溫冷凍保存一般以液態(tài)氮為冷源,使保存溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下,新陳代謝活動基本停止,處于“生機停頓”（Suspanded animation）狀態(tài)[2]。 這就有可能極大地延長儲藏種子的壽命，而不產(chǎn)生遺傳變異,從而有效地、安全地長期保存那些珍貴稀有的種質(zhì)[2]。利用液態(tài)氮保存植物種質(zhì),冷凍容器就是液氮罐，除了30～60天補充一次液氮外,不需要機械空調(diào)設備及其它管理,節(jié)省了大量的人力和物力，并且可以保持被保存組織及細胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性，是一種省時、省工、省費用的種質(zhì)超低溫保存新技術[3～5]。當解凍后，能夠恢復再生能力。

種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)是種子活力的重要指標之一[5，6]。冷凍方式和解凍方式是影響種子超低溫貯藏效果最重要的兩個因素。為此,本試驗選用稀有作物豆類、麥類、粟類中的紅小豆、蕎麥、谷子為材料，測定經(jīng)過不同的冷凍和解凍方法處理后對種子發(fā)芽率和生長勢的影響,以構(gòu)建植物種質(zhì)資源超低溫保存的最適方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅小豆、蕎麥、谷子種子購于山西省左云、興縣和朔州地方種子站。

1.2 方法

1.2.1 冷凍和解凍方法

在中國農(nóng)科院和山西農(nóng)科院鑒定種子。將種子分成三組，用聚乙烯袋包裝后冷凍：第一組種子直接投入液氮中保存；第二組種子經(jīng)-20℃（1天）→-70℃（2天）→-196℃溫度梯度冷凍；第三組經(jīng)-70℃（2天）→-196℃溫度梯度冷凍，三組保存在液氮中的種子，于保存30天后通過緩慢解凍（在18℃室溫緩慢解凍）和快速解凍（在38℃水浴鍋中解凍）兩種方法解凍。

1.2.2 超低溫保藏種子包裝材料

紅小豆、蕎麥、谷子三種種子用聚乙烯袋、鋁箔和牛皮紙袋包裝后直接投入液氮中保存30天快速解凍后發(fā)芽計算發(fā)芽率和生長勢。

1.2.3 超低溫保藏種子的含水量

1.2.3.1 種子水分調(diào)節(jié)：在裝有氧化鈣的干操器中干操或在飽和水蒸汽下吸濕，將種子調(diào)整為5種含水量范圍，分別為7% ～9%、12% ～14%、17% ～20%、30%～40%、40% ～50%。

1.2.3.2 含水量測定：整粒種子在105℃恒溫下干操24 h，以濕重為基數(shù)計算含水最。

1.2.4 種子的發(fā)芽和發(fā)芽指標的測定

將解凍后的種子于25℃黑暗中經(jīng)蒸餾水浸泡24 h后用蒸餾水沖洗數(shù)次，選取40粒飽滿健狀的種子，置于鋪墊1層濾紙、2層紗布的培養(yǎng)皿中，置于25～30℃人工氣候培養(yǎng)箱中作萌發(fā)試驗，各作三次重復，逐日記錄發(fā)芽數(shù)，并用蒸餾水沖洗補充水分。

測試種子的發(fā)芽率和生長勢，計算公式參照陶嘉齡介紹的方法[7]：發(fā)芽率 =（3天內(nèi)已發(fā)芽的種子數(shù)／全部種子數(shù)）×l00%；發(fā)芽指數(shù)（Gi）= ∑（Gt ／Dt）[式中：Gi為發(fā)芽指數(shù) ∑為總和，Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)]；活力指數(shù)（VⅠ）=Gi×S[活力指數(shù)即生長勢，S為一定時期（7天）內(nèi)幼苗長度（cm），幼苗的長度度用直尺測定]。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法

試驗原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件完成，單因素差異顯著性測驗采用鄧肯氏新復極差法完成，差異顯著水平用0.01＜P＜0.05表示，差異極顯著水平用P≤0.01表示。雙因素方差分析采用S-N-K方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍方式和解凍方式對種子發(fā)芽率和生長勢的影響

2.1.1 不同冷凍方式和解凍方式對紅小豆發(fā)芽率（%）的影響

由實驗結(jié)果（見表1、表2）可知，預凍方式對紅小豆種子超低溫保存發(fā)芽率有顯著影響。3個處理中，未經(jīng)過預凍處理直接投入液氮保存的種子在快速解凍條件下，平均發(fā)芽率為100%，顯著高于分別經(jīng)過-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→ -70℃→-196℃溫度梯度冷凍兩種預凍處理的種子發(fā)芽率 （P＜0.05）；未經(jīng)過預凍處理直接投入液氮保存的種子在緩慢解凍條件下，平均發(fā)芽率為100%，顯著高于分別經(jīng)過-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度兩種預凍處理的種子發(fā)芽率 （P＜0.05）。在-70℃→ -196℃溫度梯度與-20℃→ -70℃→ -196℃溫度梯度的預凍條件下，快速解凍時平均發(fā)芽率只達到94.59%和94.12%，保存效果差，但兩者之間未達到顯著差異；在-70℃→-196℃溫度梯度與-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度的預凍條件下，緩慢解凍時平均發(fā)芽率只達到94.12%和92.50%，保存效果差，兩者之間也未達到顯著差異。經(jīng)過預凍處理的種子在保存后發(fā)芽率都有大幅度的下降。試驗結(jié)果表明直接投入液氮方式較預凍方法 （溫度梯度）發(fā)芽率高。

表1 不同冷凍方式和解凍方式對紅小豆發(fā)芽率影響的多因素統(tǒng)計分析

表2 不同冷凍方式和解凍方式對紅小豆發(fā)芽率（%）的影響

由表1、表2可知，解凍方式對紅小豆種子的超低溫保存發(fā)芽率無顯著影響，直接投入液氮保存的種子在快速解凍和緩慢解凍的條件下發(fā)芽率均為100%；-70℃→-196℃溫度梯度冷凍種子，在快速解凍即38℃溫水浴條件下的平均發(fā)芽率與室溫18℃自然化凍方式，未達到顯著水平；-20℃→ -70℃→ -196℃溫度梯度冷凍的種子，在快速解凍即38℃溫水浴條件下的平均發(fā)芽率與室溫18℃自然化凍方式，兩者之間也未達到顯著水平。研究結(jié)果表明，解凍方式對發(fā)芽率無顯著影響。

由表1可知，冷凍方式和解凍方式交互作用：F=0.202、P=0.820＞0.05，接受無效假設，可以認為因素 a和因素b之間交互效應不顯著，即冷凍方式與解凍方式間不存在交互效應。

2.1.2 不同冷凍方式和解凍方式對紅小豆生長勢的影響

由表3、表4可以看出，預凍方式對紅小豆種子的超低溫保存生長勢有顯著影響。三個處理中，未經(jīng)過預凍處理直接投入液氮保存的種子在快速解凍條件下平均生長勢為700.23，顯著高于分別經(jīng)過-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度冷凍兩種預凍處理的種子平均生長勢 （P＜0.05）；未經(jīng)過預凍處理直接投入液氮保存的種子在緩慢解凍條件下，平均生長勢為618.39，顯著高于分別經(jīng)過-70℃→-196℃溫度梯度和-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度冷凍兩種預凍處理的種子平均生長勢 （P＜0.05）。在-70℃→-196℃溫度梯度與-20℃— → -70℃→-196℃溫度梯度的預凍條件下，快速解凍時平均生長勢分別為420.02、335.60，保存效果差，兩者之間達到顯著差異（P＜0.05）；在-70℃→ -196℃溫度梯度與-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度的預凍條件下，緩慢解凍時平均生長勢分別為343.26、279.02，保存效果差，兩者之間也達到顯著差異 （P＜0.05）。經(jīng)過預凍處理的種子在保存后生長勢都大幅度下降，且-20℃→-70℃→-196℃溫度梯度的預凍種子生長勢最低。試驗結(jié)果表明，直接投入液氮方式較預凍方法（溫度梯度）生長勢高。

表3 不同冷凍方式和解凍方式對紅小豆生長勢影響的統(tǒng)計分析

表4 不同冷凍方式和解凍方式對紅小豆生長勢的影響

由表3、表4統(tǒng)計分析結(jié)果可知，解凍方式對紅小豆種子的超低溫保存生長勢有顯著影響。未經(jīng)過預凍處理直接投入液氮保存的種子，在38℃溫水浴條件下快速解凍的平均生長勢高于室溫18℃自然化凍方式，兩者之間達到顯著水平（P＜0.05）。-70℃ → -196℃溫度梯度冷凍種子，在38℃溫水浴條件下快速解凍的平均生長勢高于室溫18℃自然化凍方式，兩者之間達到顯著水平（P＜0.05）。-20℃ → -70℃ → -196℃溫度梯度冷凍的種子，在38℃溫水浴條件下快速解凍的平均生長勢高于室溫18℃自然化凍方式，兩者之間達到顯著水平（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，快速解凍方式較自然化凍方法生長勢高。

由表3可知，冷凍方式和解凍方式交互作用：F=0.167、P=0.848＞0.05，接受無效假設，可以認為因素 a和因素b之間交互效應不顯著，即冷凍方式與解凍方式間不存在交互效應。

綜上所述，超低溫保存紅小豆種子應選擇未經(jīng)過預凍處理直接投入液氮保存方法：解凍應采用快速解凍方法。

不同冷凍方式和解凍方式對蕎麥和谷子種子發(fā)芽率和生長勢的影響規(guī)律與對紅小豆種子的影響規(guī)律類似，故相關試驗數(shù)據(jù)從略。

2.2 不同包裝材料對超低溫保存種子發(fā)芽率和生長勢的影響

三種包裝材料對超低溫保存紅小豆種子發(fā)芽率和生長勢的影響見表5，聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝種子在液氮保存30天的發(fā)芽率顯著高于用牛皮紙包裝的；而聚乙烯塑料袋包裝與鋁箔包裝種子的發(fā)芽率無顯著差異。三種包裝材料包裝種子在液氮保存30天的發(fā)芽勢無顯著差異。試驗結(jié)果說明，液氮保存種子使用聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝材料好于牛皮紙包裝。

蕎麥和谷子種子在使用包裝材料上和紅小豆結(jié)果一樣，即聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝材料好于牛皮紙包裝。

2.3 超低溫保存種子含水量對發(fā)芽率和生長勢的影響

表5 不同包裝材料對超低溫保存紅小豆種子發(fā)芽率和生長勢的影響

2.3.1 不同含水量對超低溫保存紅小豆種子發(fā)芽率和生長勢的影響

由表6可知，含水量為7.89%、12.48%、18.77%、36.91%和40.12%的紅小豆種子在液氮中保存30天后，發(fā)芽率差異顯著（P＜0.05），發(fā)芽率從高到低的順序為12.48%＞7.89%＞18.77%＞36.91%＞40.12%。12.48%含水量紅小豆種子在液氮中保存30天后生長勢顯著高于其它四種含水量的種子；36.91%和40.12%含水量種子的生長勢最低，兩者無顯著差異；7.89%和18.77%含水量種子的生長勢次之，兩者無顯著差異。實驗結(jié)果明，12.48%含水量（自然風干）的紅小豆在液氮中保藏效果最好。

2.3.2 不同含水量對超低溫保存蕎麥種子發(fā)芽率和生長勢的影響

由表7可知，含水量為7.21%、12.63%、17.59%、36.37%和40.29%的蕎麥種子在液氮中保存30天后，發(fā)芽率和生長勢差異顯著 （P＜0.05），12.63%含水量種子的發(fā)芽率和生長勢顯著高于其它四種含水量 （P＜0.05）；7.21%含水量種子的發(fā)芽率和生長勢顯著高于17.59%、36.37%和 40.29%的含水量 （P＜0.05）；17.59%含水量種子的發(fā)芽率和生長勢顯著高于36.37%的含水量（P＜0.05）；與40.29%含水量種子的發(fā)芽率和生長勢無顯著差異。試驗結(jié)果說明，12.63%含水量（自然風干）的蕎麥種子在液氮中保藏效果最好。

表7 不同含水量對超低溫保存蕎麥種子發(fā)芽率和生長勢的影響

2.3.3 不同含水量對超低溫保存谷子種子發(fā)芽率和生長勢的影響

由表8可知，含水量為7.39%、13.15%、18.16%、36.68%和40.59%的谷子種子在液氮中保存30天后發(fā)芽率和生長勢差異類同，13.15%含水量種子的發(fā)芽率和生長勢顯著高于其它四種含水量 （P＜0.05），18.16%含水量種子的發(fā)芽率和生長勢顯著高于7.39%、36.68%和40.59%的含水量（P＜0.05）；后三者含水量種子的發(fā)芽率和生長勢無顯著差異。試驗結(jié)果說明，13.15%含水量（自然風干）的谷子種子在液氮中保藏效果最好。

表8 不同含水量對超低溫保存谷子種子發(fā)芽率和生長勢的影響

從三種農(nóng)作物（紅小豆、蕎麥和谷子）種子的7%～9%、12% ～14%、17% ～20%、30% ～40%、40% ～50%五個含水量的發(fā)芽試驗結(jié)果可知，12%～14%含水量（自然風干）范圍適合液氮保存。

3 討論

本試驗對預冷和直接在液氮中的冷凍方法和解凍方法對種子生活力的影響進行了初步研究，觀察到經(jīng)過快速冷凍和快速解凍處理的種子效果最好。

細胞結(jié)構(gòu)的完整性是種子活力的基礎[8]。將植物種子直接投入液氮中保存，降溫速度極快，種子內(nèi)的水分在降溫冷凍過程中，從-10℃～-140℃范圍內(nèi)是冰晶形成和增長的危險溫度區(qū)，到-140℃時完全停止增長，利用高速降溫越過冰晶增長的危險溫度區(qū)，不能形成致死的冰晶，細胞內(nèi)水分固化，不會破壞細胞結(jié)構(gòu)。快速冷凍是一種以快速通過冰晶生長危險溫度區(qū)使種子進入玻璃化[4]，從而減小細胞傷害的有效途徑。而預冷的種子降溫速度慢，不能越過危險溫度區(qū)，冰晶形成并增長，破壞細胞結(jié)構(gòu)。因此，快速冷凍效果最佳。

超低溫保存中，冰凍傷害有時在冰凍過程中不發(fā)生，但在解凍過程中發(fā)生[9]。-5～-10℃是再結(jié)冰的溫度區(qū)，緩慢解凍時，細胞內(nèi)易發(fā)生劇烈再結(jié)晶和冰晶體增大，使細胞死亡；快速解凍能使其通過危險溫度區(qū)而防止解凍過程中再結(jié)晶，冰晶體增大，對細胞無損傷，細胞膜不漲裂，種子仍有較高活力；緩慢解凍的種子破壞細胞結(jié)構(gòu)，細胞膜受到損傷，修復能力減弱，種子活力降低。解凍速度是解凍技術的關鍵。解凍速度慢，細胞內(nèi)容易發(fā)生再結(jié)晶而導致細胞死亡；解凍速度快來不及再結(jié)晶，細胞存活，所以快速解凍優(yōu)于緩慢解凍。

植物種子液氮保存時都有一個適宜的含水量范圍。液氮保存并非含水量越低越好，含水量降到一定極限則產(chǎn)生脫水損傷，導致種子發(fā)芽能力傷失[9]。本試驗探究不同含水量對液氮保存種子發(fā)芽率的影響，結(jié)果顯示，低含水量（7%～9%）的種子保存在液氮中的發(fā)芽率低于自然風干種子（12%～14%）的發(fā)芽率。

由本實驗研究結(jié)果可知，快速冷凍和快速解凍處理的種子效果最好，低含水量（7%～9%）的種子保存在液氮中的發(fā)芽率低于自然風干種子 （12%～14%）的發(fā)芽率；采用不同包裝材料包裝紅小豆、蕎麥和谷子種子于液氮保存測定發(fā)芽率和生長勢，結(jié)果顯示聚乙烯塑料袋和鋁箔包裝材料好于牛皮紙包裝。

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