伍海燕 宋燕 張萍 姜照 王培娟 王彥青 寧文吉 韓文清▲

1.山東省煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東煙臺(tái) 264003；2.山東省煙臺(tái)市開發(fā)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東煙臺(tái) 264006

一起由非脫羧勒克菌引起食物中毒的調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)與分析

伍海燕1宋燕1張萍1姜照1王培娟2王彥青1寧文吉1韓文清1▲

1.山東省煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心，山東煙臺(tái) 264003；2.山東省煙臺(tái)市開發(fā)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東煙臺(tái) 264006

目的對(duì)一起食物中毒的采集樣本進(jìn)行相關(guān)微生物學(xué)檢驗(yàn)，確定引起食物中毒的病原菌，并進(jìn)行16S rRNA序列分析確定其歸屬。方法根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查及臨床表現(xiàn)，選擇疑似的病原菌，根據(jù)GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB/T4789-2010、WS/T9-1996、《衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)》對(duì)采集的樣品進(jìn)行病原菌分離與鑒定，對(duì)菌株的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果從1份疑似中毒食物魚香茄子中檢出非脫羧勒克菌，該菌株屬于阿氏腸桿菌。結(jié)論綜合流行病學(xué)調(diào)查、臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，提示該次食物中毒由非脫羧勒克菌污染食物所致。

食物中毒；非脫羧勒克菌；污染

非脫羧勒克菌是屬于勒克菌屬中唯一的菌種，在1986年提議命名，是一種罕見的腸桿菌科細(xì)菌，該細(xì)菌能夠在動(dòng)物、植物、食物和水等環(huán)境中生存，也能在一些臨床樣本中分離到，如血液、糞便、痰液和尿液等。非脫羧勒克菌在一定條件下可以成為對(duì)人體具有致病力的病原菌，并與人類腹瀉關(guān)系密切，有報(bào)道曾在腹瀉患者糞便和痰液中檢出，對(duì)小白鼠有一定致病力[1]。

1 流行病學(xué)調(diào)查

2011年8月3日山東省煙臺(tái)市疾病預(yù)防控制中心接到報(bào)告，本市某企業(yè)餐廳就餐職工相繼出現(xiàn)腹瀉、腹痛、嘔吐等癥狀。該公司位于煙臺(tái)市區(qū)西部，現(xiàn)有員工約8萬(wàn)人，公司園區(qū)供餐場(chǎng)所共計(jì)57個(gè)，廠區(qū)有員工餐廳37個(gè)，中央廚房3個(gè)，主要有3家餐飲供應(yīng)商。首發(fā)病例時(shí)間為2011年8月2日12∶00時(shí)左右，發(fā)病高峰出現(xiàn)在同年8月3日00∶00～9∶10，此時(shí)間段共有42例發(fā)病。截至8月3日15∶00共有45例發(fā)病，潛伏期12～30 h。45例發(fā)病者主要臨床癥狀為腹瀉45例，腹痛43例，惡心39例，嘔吐32例，嘔吐次數(shù)以3～5次/d為主，部分患者有發(fā)熱癥狀，少數(shù)頭痛、頭暈，癥狀較輕，但反復(fù)遷延，未出現(xiàn)異常神經(jīng)和精神癥狀。腹瀉物性狀以黃色米泔水樣便為主，腹瀉次數(shù)以3～10次/d為主，腹痛主要為上腹部和臍周絞痛，經(jīng)及時(shí)補(bǔ)液和抗菌治療后發(fā)病者情況均逐步緩解。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品來(lái)源

流調(diào)現(xiàn)場(chǎng)采集179份剩余食物樣品，10份大便，2份嘔吐物。

2.2 培養(yǎng)基試劑及診斷血清

本次試驗(yàn)用培養(yǎng)基、生化試劑均來(lái)自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌鑒定試劑盒ID32E，由法國(guó)梅里埃提供；沙門菌屬診斷血清、志賀菌屬診斷血清均由寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司提供。Taq DNA聚合酶、dNTPsDNA、Marker、pmD18-T載體均購(gòu)自Takara公司；全血基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)于天根公司；DH5ɑ購(gòu)自大連寶生物公司。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

2.3 檢驗(yàn)項(xiàng)目和方法

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查及臨床表現(xiàn)，主要檢測(cè)沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌。檢測(cè)方法按GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB/T4789-2010《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》[2]和《衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)》[3]對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用法國(guó)梅里埃ATB微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

2.4 病原菌分離鑒定[4]

2.4.1 分離培養(yǎng)將采集的樣品直接劃線接種HE平板、TCBS平板、哥倫比亞血平板；同時(shí)分別接種緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌液、7.5%氯化鈉肉湯、3%氯化鈉堿性蛋白胨水，18～24 h增菌培養(yǎng)后劃線接種以上選擇性平板。培養(yǎng)后接種的相關(guān)選擇性培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)沙門菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌的可疑菌落，但在HE平板上發(fā)現(xiàn)了菌落形態(tài)一致的疑似志賀菌菌落。

2.4.2 生物特征在HE平板上的典型菌落較小，圓形、光滑、凸起、透明、無(wú)色。挑起HE平板上的可疑菌落接種TSI斜面培養(yǎng)18～24 h，底層變黃無(wú)氣體，斜面變紅。經(jīng)革蘭染色和鏡檢，菌落呈G-，短小無(wú)芽孢桿菌。

2.4.3 生化鑒定上述優(yōu)勢(shì)菌株純化后接種腸桿菌科細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.4.4 儀器分析上述分離純化的優(yōu)勢(shì)菌株同時(shí)也接種腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌鑒定試劑盒ID32E，采用法國(guó)梅里埃ATB微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，生化反應(yīng)如表2所示，鑒定結(jié)果（124號(hào)樣品）為非脫羧勒克菌，%id= 99.6，T=0.97。

2.4.5 血清學(xué)試驗(yàn)上述志賀菌疑似菌落純化后分別與志賀菌屬診斷血清凝集反應(yīng)，結(jié)果顯示與痢疾5-8型血清發(fā)生交叉凝集。

2.4.6 病原菌分離鑒定結(jié)果根據(jù)分離培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果：179份剩余食物樣品中，從1份魚香茄子中檢出非脫羧勒克菌，10份大便，2份嘔吐物未檢出。

2.5 16 S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

2.5.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank登錄的原核生物16S rRNA基因設(shè)計(jì)通用引物，上游引物為27F：5’-gWATTACCgCggCK-gCTg-3’；下游引物為519R：5’-gWATTACCgCggCKgCTg-3’。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp左右。

2.5.2 全基因組提取刮取經(jīng)純培養(yǎng)的非脫羧勒克菌菌落，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。

2.5.3 16 S r RNA基因的PCR擴(kuò)增通過設(shè)計(jì)合成的原核生物16S rRNA基因，設(shè)計(jì)通用引物對(duì)所提取的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，其中，Mix Buffer 25μL，27F 2μL，519R 2μL，ddH2O 16μL，DNA 5μL。程序PCR如下：94℃變性5min；接著按以下程序循環(huán)30次：94℃變性30 s，52℃復(fù)性30 s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2.5.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果采用BLAST軟件將測(cè)序菌株16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)菌株的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果與阿氏腸桿菌LF7a的同源性達(dá)99.8%，可認(rèn)定為同一個(gè)種。

3 討論

本次腹瀉經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)合臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果，懷疑可能是由非脫羧勒克菌污染食物所致。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中，未檢出沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌。病原菌污染及混合污染食物而引起食物中毒導(dǎo)致腹瀉的事件時(shí)有報(bào)道[5-6]，但是罕見的非脫羧勒克菌污染食物在煙臺(tái)地區(qū)尚屬首例。

本研究分離菌，形態(tài)、生化特征與已有報(bào)道基本符合，故可初步定為非脫羧勒克菌。根據(jù)菌株的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，采用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)各項(xiàng)結(jié)果，初步鑒定YT-1107菌株屬于腸桿菌屬（Enterobacter），與菌株阿氏腸桿菌LF7a為同一物種。

在本次檢驗(yàn)過程中，觀察非脫羧勒克菌在HE平板上生長(zhǎng)表現(xiàn)出的生物特征與志賀菌極為相似，且與其血清發(fā)生交叉凝集，易誤判，但生化反應(yīng)結(jié)果與志賀菌不同，結(jié)合全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，最終判定為非脫羧勒克菌。近年來(lái)，關(guān)于非脫羧勒克菌在臨床[7]、食品[8]中被檢出的報(bào)道增多，但仍然缺乏對(duì)其全面系統(tǒng)的研究[9]，建議重視該菌的分類地位和臨床價(jià)值，為防范其在食品安全方面的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供詳實(shí)依據(jù)。

食品安全問題關(guān)系每個(gè)人的切身利益。保障食品安全，減少食物中毒事件的發(fā)生，首先要加強(qiáng)對(duì)食品安全領(lǐng)域的監(jiān)管力度，包括食品的生產(chǎn)、加工、銷售等環(huán)節(jié)；其次要通過宣傳等方式提高公眾的食品衛(wèi)生安全意識(shí)；最后要完善食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的建設(shè)，確定危害因素的分布和可能來(lái)源，及時(shí)發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。

表2 全自動(dòng)生化鑒定結(jié)果

[1]陳偉峰，洪舒音，趙秀玲.速凍南瓜泥中檢出罕見的非脫羧勒克菌[J].食品科技，2010，35（12）：311-313.

[2]GB/T4789-2003/2008/2010.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社.

[3]何曉青.衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)[M].北京：新華出版社，1989：301，479.

[4]唐珊熙.微生物學(xué)及微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998： 175-176.

[5]高亞色，李恩.一株由奇異變形桿菌和倫敦沙門菌引起食物中毒的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（9）：2222-2223.

[6]陳玉貞.食源性病原微生物流行病學(xué)特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室診斷[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2010：61-66.

[7]王遷，馬金群.從血液標(biāo)本中分離到1株非脫羧勒克菌[J].中華醫(yī)院感染學(xué)志，2008，18（4）：578.

[8]杜強(qiáng)，錢紅.從真空包裝食品中檢出罕見的非脫羧勒克菌[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（4）：502-503.

[9]陳太基，封幼玲，王為云，等.一株非脫羧勒克氏菌的分離鑒定報(bào)告[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1997，7（2）：120.

Laboratory test and analysis on a food poisoning event due to contam ination w ith Leclercia adecarboxylata

WU Haiyan1 SONG Yan1 ZHANG Ping1 JIANG Zhao1 WANG Peijuan2 WANG Yanqing1 NING Wenji1 HAN Wenqing1▲
1.Yantai Centers for Disease Control and Prevention,Shandong Province,Yantai 264003,China;2.Yantai Development Zone Centers for Disease Control and Prevention,Shandong Province,Yantai 264006,China

ObjectiveTo conductmicrobiological test of samples collected from a food poisoning event,in order to identify the pathogen caused food poisoning,analyze 16S rRNA sequence and identify its ownership.MethodsAccording to epidemiological investigation and clinical manifestation,suspected pathogens were selected.According to GB/T4789-2003, GB/T4789-2008,GB/T4789-2010,WS/T9-1996 and Bacteriological Inspection for Health and Disease Prevention, pathogens were isolated from samples and identified.The results of 16S rRNA gene sequencing of strains were analyzed. Results Leclercia adecarboxylata was detected out from 1 suspicious food sample of braised eggplant.The pathogen belonged to Enterobacter asburiae.ConclusionIntegration of epidemiology investigation,clinical data and laboratory test results,This food poisoning event is caused by contamination with Leclercia adecarboxylata.

Food poisoning;Leclercia adecarboxylata;Pollution

R155.3+1

C

1673-7210（2012）11（c）-0136-03

伍海燕（1965-），女，副主任技師，主要從事食品微生物檢驗(yàn)方面研究。

▲通訊作者

2012-07-27 本文編輯：程銘）