朱 艷 朱玉廣 張立華 鐘瑩瑩 杜孝楠 張 榮 王 杰

晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)的轉(zhuǎn)分化是后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)的主要病理改變[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)是促進(jìn) LEC 轉(zhuǎn)分化最主要的因子[2-3]。TGF-β可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞整合素β1的表達(dá)[4]，但TGF-β對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLEC)整合素 β1 表達(dá)的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是整合素β1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，整合素介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的黏附能夠激活ERK信號(hào)通路。最近研究發(fā)現(xiàn)，整合素介導(dǎo)的信號(hào)通道參與了TGF-β2介導(dǎo)的LEC移行[5]。因此，我們推測(cè)，整合素介導(dǎo)的ERK/MAPK信號(hào)通道可能參與了LEC轉(zhuǎn)分化過(guò)程。為了驗(yàn)證推測(cè)，我們?cè)O(shè)計(jì)此課題，以探討PCO的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胎牛血清(Gibco公司)、TGF-β2(Perprotech 公司)、兔抗人整合素β1抗體、兔抗人磷酸化ERK(pERK)抗體、兔抗人F-actin抗體(Santa Cruz公司)、二步法免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋)、PCR擴(kuò)增試劑盒(Casarray公司)、PCR引物(上海生工)。

1.2 HLEC的培養(yǎng)與傳代 人晶狀體取自本院角膜移植術(shù)后供體眼球(死亡時(shí)間＜24 h，年齡＜40歲)。供體眼球用體積分?jǐn)?shù)70%酒精消毒，慶大霉素溶液沖洗。無(wú)菌條件下剖開(kāi)眼球，除去角膜和虹膜，沿赤道部剖開(kāi)晶狀體，將前囊膜剪成1 mm×1 mm組織塊，種植在培養(yǎng)皿中，滴入2滴DMEM培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿放入溫箱貼壁0.5～1.0 h。取出培養(yǎng)皿，加入含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以后每3～4 d換1次培養(yǎng)液。1～2周近融合，待細(xì)胞90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化，1∶3傳代，選擇傳5代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)TGF-β2對(duì)HLEC增殖的影響將HLEC以每孔10×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，孵育24 h后加入 TGF-β2使之終質(zhì)量濃度分別為 0 ng·L－1和 10 ng·L－1、33 ng·L－1、100 ng·L－1、333 ng·L－1、1000 ng·L－1，每組 6 孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h，之后加入 MTT 溶液(每孔20 μL)，孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，加入 DMSO 每孔 150 μL，振蕩 10 min，結(jié)晶充分溶解后，在Powerwave XS全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)上測(cè)量其在490 nm處的吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。根據(jù)MTT法結(jié)果選擇最佳TGF-β2干涉濃度、刺激時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) HLEC中整合素 β1、pERK、F-actin的表達(dá) 制作細(xì)胞爬片，待HLEC達(dá)80%融合后，血清饑餓培養(yǎng)24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為100 ng·L－1TGF-β2的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，檢測(cè)整合素β1、pERK、F-actin的表達(dá)。

光鏡下細(xì)胞漿含棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。每組各取5張爬片，每張爬片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，使用Imagepro plus顯微圖像分析系統(tǒng)，得出陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的吸光度A值，進(jìn)行分析。

1.5 RT-PCR 檢測(cè) HLEC 中整合素 β1、pERK、F-actin mRNA的表達(dá) 收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HLEC，Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，按PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明步驟，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列:整合素β1 415 bp，上游引物5’-TCAAGCGGGCTGAAGACTATCC-3’，下游引物 5’-AGCCGTGTCACATTCCACCAAC-3’;pERK 31 bp，上游引物 5’-TGCTGCTCTGCCTTTGTCTGC-3’，下游引物5’-CCCACCTCCACTTCTGTTCACC-3’;F-actin 433 bp，上游引物5’-AGGTGCAGGAGAAGTCCAGTG’，下游引物 5’-GAGGGAGCAGGAAACGAGTGT-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，Eagle EyeⅡ型圖像系統(tǒng)分析，得出代表各電泳條帶產(chǎn)量的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算整合素β1、pERK及F-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各樣本經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)TGF-β2對(duì)HLEC增殖的影響選取10～1 000 ng·L－1中5 個(gè)濃度的 TGF-β2 分別作用于 HLEC，作用時(shí)間為 12 h、24 h、48 h、72 h。結(jié)果表明，當(dāng)作用濃度為100 ng·L－1時(shí)達(dá)到了最強(qiáng)的抑制作用。取最佳TGF-β2干涉濃度100 ng·L－1分別作用于 HLEC 12 h、24 h、48 h、72 h，結(jié)果表明，培養(yǎng)48 h達(dá)到了最強(qiáng)的抑制作用(圖1)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)整合素β1、pERK、F-actin的表達(dá) 對(duì)照組HLEC表達(dá)整合素β1、pERK及F-actin，吸光度 A 值分別為 0.045 ±0.011、0.025 ±0.009、0.079 ±0.024;實(shí)驗(yàn)組 HLEC 中整合素 β1、pERK及F-actin表達(dá)的相對(duì)表達(dá)量分別為0.116±0.031、0.123 ±0.028、0.140 ±0.033，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.01)。TGF-β2明顯促進(jìn)整合素β1、pERK及F-actin的表達(dá)(圖2)。

2.3 RT-PCR 檢測(cè)整合素 β1、pERK、F-actin mRNA的表達(dá) 整合素β1、pERK及F-actin mRNA和管家基因β-actin mRNA經(jīng)RT-PCR后，分別產(chǎn)生1條415 bp、312 bp、433 bp及578 bp的電泳條帶。圖像分析系統(tǒng)分析顯示，對(duì)照組整合素β1、pERK及F-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.246±0.051、0.338 ± 0.092、0.138 ± 0.027，實(shí) 驗(yàn)組分 別為0.658 ±0.146、0.582 ±0.171、0.760 ±0.193，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01)。TGF-β2明顯促進(jìn)整合素β1、pERK及F-actin mRNA的表達(dá)(圖3)。

Figure 1 Effect of TGF-β2 on proliferation of HLEC.A:Different concentrations of TGF-β2;B:Different treated time of TGF-β2 TGF-β2 對(duì) HLEC增殖的影響。A:TGF-β2的作用濃度;B:TGF-β2的作用時(shí)間

Figure 2 Immunohistochemistry staining image of HLEC in experimental group(SP，×400).A:Integrin β1;B:pERK;C:F-actin 實(shí)驗(yàn)組 HLEC 免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖像(SP，×400)。A:整合素β1;B:pERK;C:F-actin

Figure 3 Electrophoresis results of RT-PCR.CG:Control group;EG:Experimental group RT-PCR電泳結(jié)果。CG:對(duì)照組;EG:實(shí)驗(yàn)組

3 討論

PCO是白內(nèi)障摘出術(shù)后后囊膜的繼發(fā)混濁，是影響術(shù)后遠(yuǎn)期視力的最主要原因。目前認(rèn)為，術(shù)后殘留的HLEC增殖、移行及轉(zhuǎn)分化是引起PCO的主要原因[3]。

TGF-β2是重要的調(diào)節(jié)因子，與囊膜下型白內(nèi)障以及PCO的形成有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2能夠誘導(dǎo)LEC發(fā)生異常的生長(zhǎng)、分化[6]并發(fā)生凋亡，導(dǎo)致體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體發(fā)生前囊膜下混濁[7-8]。1994年Liu等[9]首次發(fā)現(xiàn) TGF-β 可以誘導(dǎo)鼠 LEC發(fā)生轉(zhuǎn)分化之后，轉(zhuǎn)分化在PCO形成中的作用日益受到人們的關(guān)注。

整合素屬于黏附分子超家族成員，主要涉及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，參與細(xì)胞黏附、移行和再循環(huán)[10]。Nishi等[11]用免疫組織化學(xué)的方法證明整合素β1在LEC中存在，認(rèn)為整合素直接或間接參與了LEC對(duì)后囊膜的黏附，提示整合素分子在PCO的形成上具有一定作用。

目前對(duì)于整合素β1介導(dǎo)的LEC轉(zhuǎn)分化的上游信號(hào)通路的研究逐漸增多。MAPK信號(hào)途徑是整合素β1介導(dǎo)的信號(hào)通路之一，MAPK包括ERK、JNK、P38通路。ERK途徑與轉(zhuǎn)分化有關(guān)，是MAPK的經(jīng)典途徑。MAPK的活化調(diào)控許多生物效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖及整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)分化等[12]。最近發(fā)現(xiàn)，整合素介導(dǎo)的信號(hào)通道參與了TGF-β2介導(dǎo)的LEC的移行[5]。但整合素β1介導(dǎo)的MAPK通道在LEC轉(zhuǎn)分化中的作用未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中，在TGF-β2的誘導(dǎo)下，我們用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)到HLEC表達(dá)整合素β1和pERK明顯增多，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示HLEC中整合素β1 mRNA和pERK mRNA表達(dá)也明顯增多。提示在TGF-β2的誘導(dǎo)下整合素β1的表達(dá)增多，并激活了整合素 β1介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路——ERK/MAPK信號(hào)通路。同時(shí)，作為細(xì)胞骨架蛋白主要成分之一的F-actin及其mRNA的表達(dá)明顯上升，提示整合素β1介導(dǎo)的ERK/MAPK信號(hào)通路可能參與了HLEC轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，促進(jìn)了PCO的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2誘導(dǎo) HLEC整合素 β1、pERK和F-actin的表達(dá)明顯升高。我們推測(cè)可能的機(jī)制為:TGF-β2一方面抑制了HLEC的增殖，另一方面誘導(dǎo)了整合素β1的表達(dá);整合素β1一方面介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白(F-actin)與細(xì)胞外基質(zhì)連接，促使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、移行使后囊發(fā)生皺縮，參與PCO的形成，另一方面介導(dǎo)ERK/MAPK信號(hào)通道的表達(dá)，作用于細(xì)胞骨架蛋白，從而使F-actin表達(dá)增加，引起HLEC發(fā)生黏附、移行，參與PCO的發(fā)生。但ERK/MAPK信號(hào)通道并沒(méi)有引起HLEC的增殖，推測(cè)可能有其他信號(hào)通路參與。但是，作為PCO發(fā)生的重要信號(hào)通路，整合素β1介導(dǎo)的ERK/MAPK通道可能為PCO的防治提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

1 Suetsugu-Maki R，Maki N，F(xiàn)ox TP，Nakamura K，Cowper-Solari R.A complement receptor C5a antagonist regulates epithelial to mesenchymal transition and crystallin expression after lens cataract surgery in mice[J].Mol Vis，2011，17:949-964.

2 de Iongh RU，Wederell E，Lovicu FJ，McAvoy JW.Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition in the lens:a model for cataract formation[J].Cells Tissues Organs，2005，179(1-2):43-55.

3 Yao K，Ye PP，Tan J，Tang XJ，Shen Tu XC.Involvement of PI3K/Akt pathway in TGF-beta2-mediated epithelial mesenchymal transition in human lens epithelial cells[J].Ophthalmic Res，2008，40(2):69-76.

4 Margadant C，Sonnenberg A.Integrin-TGF-beta crosstalk in fibrosis，cancer and wound healing[J].EMBO Rep，2010，11(2):97-105.

5 Yao K，Tan J，Ye P，Wang K，Xu W，Shen Tu X，et al.Integrin beta 1-mediated signaling is involved in transforming growth factor-beta 2-promoted migration in human lens epithelial cells[J].Mol Vis，2007，13:1769-1776.

6 Hales AM，Chamberlain CG，MCAvoy JW.Cataract induction in lenses cultured with transforming growth factor-β[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36(8):1709-1713.

7 Srinivasan Y，Lovicu FJ，Overbeek PA.Lens-specific expression of transforming growth factor βl in transgenic mice causes anterior subcapsular cataracts[J].J Clin Invest，1998，101(3):625-634.

8 Gordon-Thomson C，de Iongh RU，Hales AM，Chamberlain CG，McAvoy JW.Differential cataract genic potency of TGF-beta l，beta 2，and beta 3 and their expression in the postnatal rat eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39(8):1399-1409.

9 Liu J，Hales AM，Chamberlain M，McAvoy JW.Induction of cataract-like changes in rat lens epithelial explants by transforming growth factor-beta[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(2):388-401.

10 Baker EL，Zaman MH.The biomechanical integrin[J].J Biomech，2010，43(1):38-44.

11 Nishi O，Nishi K，Mano C，Ichihara M，Honda T，Saitoh I.Inhibition of migrating lens epithelial cells by blocking the adhesion molecule integrin:a preliminary report[J].J Cataract Refract Surg，1997，23(6):860-865.

12 Cargnello M，Roux PP.Activation and function of the MAPKs and their substrates，the MAPK-activated protein kinases[J].Microbiol Mol Biol Rev，2011，75(1):50-83.