劉 欣 黃敏麗

外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy，TON)是因各種外力傷及頭部或眼部后發(fā)生的視神經(jīng)損傷，最終誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)死亡(主要是通過細胞凋亡的方式)，其結(jié)果常導(dǎo)致視力永久性喪失[1]。隨著交通及體育運動的發(fā)展，TON發(fā)病率逐漸增多，已成為常見的眼外傷急癥。時至今日，臨床上對此病尚無有效的治療方法，雖可行視神經(jīng)管減壓開放術(shù)和大劑量糖皮質(zhì)激素治療，但也只能挽救部分視力，視功能損害已不可逆轉(zhuǎn)。因此，尋找安全有效的新療法，已經(jīng)成為TON發(fā)生后視功能保護研究的熱點和難點。Colivelin是一種新近合成的生物活性肽，具有神經(jīng)保護作用，能夠促進受損初級皮層神經(jīng)元的存活[2]。本研究通過建立大鼠視神經(jīng)夾傷模型來探討不同劑量Colivelin對視神經(jīng)的保護作用及其機理，為臨床防治視神經(jīng)損傷性疾病提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 健康清潔級2月齡雌性Wistar大鼠40只(80眼，廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，體質(zhì)量230～300 g，統(tǒng)一編號后隨機分為模型組、安慰劑組及Colivelin低劑量組、Colivelin中劑量組、Colivelin高劑量組，每組8只，均做單側(cè)視神經(jīng)損傷模型，模型組一側(cè)未做任何處理的8眼為空白對照組。

1.1.2 實驗試劑和儀器 無創(chuàng)血管夾(上海醫(yī)療器械公司)，微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)，病理圖像分析系統(tǒng)(德國LEICA公司)，Colivelin(上海吉爾生化有限公司)，TUNEL試劑盒(德國Roche公司)，Caspase-3抗體(美國 NeoMarkers公司)，DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物損傷模型的建立 100 g·L－1水合氯醛(350 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，在手術(shù)顯微鏡下切開外眥，沿角膜緣向上剪開球結(jié)膜至10點鐘位，向前牽拉眼球，在眼外肌之間鈍性分離，暴露視神經(jīng)，于球后2 mm處用無創(chuàng)血管夾夾閉視神經(jīng)20 s。眼底檢查視網(wǎng)膜血管無出血及梗塞為造模成功，納入實驗觀察。

1.2.2 大鼠用藥劑量及方法 將Colivelin溶于磷酸緩沖液(PBS)，配制成濃度為 10－6μmol·L－1、10－4μmol·L－1及 10－2μmol·L－1的溶液。根據(jù)分組不同自外傷后起30 min，用微量進樣器向玻璃體內(nèi)注射不同濃度的藥物5 μL:Colivelin低劑量組注射10－6μmol·L－1Colivelin，Colivelin 中劑量組注射10－4μmol·L－1Colivelin，Colivelin 高劑量組注射10－2μmol·L－1Colivelin，安慰劑組注射 PBS 緩沖液，空白對照組及模型組不給予任何治療。

1.2.3 標本取材及切片制作 各組動物于注藥7 d后，用頸椎脫臼法處死，立即摘除眼球，40 g·L－1多聚甲醛固定，1 d后于鋸齒緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)及眼內(nèi)容物，石蠟包埋，將眼球沿縱向做5 μm視網(wǎng)膜連續(xù)切片。每只眼球取3張切片，每張切片取3個視野(400倍)。

1.2.4 觀察項目和方法 視網(wǎng)膜后極部前后方向全層切片HE染色后，觀察各組視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化并進行RGC計數(shù)，RGC計數(shù)為視網(wǎng)膜切片3個400倍光鏡視野下RGC計數(shù)的平均值。TUNEL染色后觀察凋亡細胞所在細胞層次，RGC平均凋亡率為3個400倍光鏡視野下RGC凋亡細胞數(shù)與RGC總數(shù)之比。免疫組織化學(xué)法觀察3個400倍光鏡視野下視網(wǎng)膜中caspase-3的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，運用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，并用LSD檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜HE染色

2.1.1 病理組織形態(tài)學(xué)觀察 空白對照組大鼠視網(wǎng)膜層次清晰，各層細胞排列整齊密集，細胞核清楚;模型組及安慰劑組可見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)明顯變薄，RGC排列稀疏，細胞數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)大量核固縮;Colivelin低劑量組部分RGC出現(xiàn)核固縮，與模型組和安慰劑組相比，RGC數(shù)目有所增加;Colivelin高劑量組僅見少量RGC核固縮，RGC數(shù)目明顯增加，各層細胞排列整齊、致密;Colivelin中劑量組病理改變程度居低劑量組與高劑量組之間(圖1)。

2.1.2 RGC計數(shù) 注藥后7 d，空白對照組每400倍光鏡視野下RGC數(shù)量為25.750±1.264;模型組及安慰劑組 RGC數(shù)量下降明顯，分別為8.236±1.239和8.514±1.222;Colivelin治療后 RGC 數(shù)量較模型組、安慰劑組增加，其中，Colivelin低劑量組RGC 數(shù)量為 14.500 ±1.021，Colivelin中劑量組為16.250±1.319，Colivelin高劑量組為 18.097±1.323。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，除模型組與安慰劑組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)外，其他各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05)，且RGC計數(shù)隨Colivelin藥物濃度增加而增加。

2.2 TUNEL染色及計數(shù)結(jié)果 TUNEL染色結(jié)果見圖2。模型組和安慰劑組注藥后7 d TUNEL染色可見大量凋亡細胞，Colivelin治療組凋亡細胞數(shù)量隨Colivelin注射濃度的增加依次遞減。模型組RGC細胞凋亡率為(60.928±2.961)%，安慰劑組為(61.446±2.755)%，Colivelin低劑量組為(58.432± 2.835)%，中劑量組為(51.948±2.802)%，高劑量組為(47.656±2.331)%?？瞻讓φ战M視網(wǎng)膜切片TUNEL染色未見明顯凋亡細胞。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，模型組與安慰劑組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其他各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05)。

Figure 1 Retinal HE staining(×400).A:Normal control group;B:Model group;C:PBS control group;D:Low-dose colivelin group;E:Medium-dose colivelin group;F:High-dose colivelin group 視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400)。A:空白對照組;B:模型組;C:安慰劑組;D:Colivelin低劑量組;E:Colivelin中劑量組;F:Colivelin高劑量組

2.3 Caspase-3標記及計數(shù)結(jié)果 Caspase-3免疫組織化學(xué)的陽性表達為細胞核及細胞漿呈棕黃色。結(jié)果顯示，空白對照組視網(wǎng)膜觀察不到陽性染色，模型組、安慰劑組、Colivelin低劑量組、Colivelin中劑量組、Colivelin高劑量組均可觀察到陽性染色，主要位于RGC層、內(nèi)核層及外核層(圖3)?？瞻讓φ战Mcaspase-3平均光密度值極低，為0.177±0.133;模型組及安慰劑組的表達明顯增強，分別為0.482±0.012和0.486±0.012，但此兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Colivelin低劑量組、Colivelin中劑量組、Colivelin高劑量組caspase-3平均光密度值分別為0.411±0.017、0.326 ±0.018、0.234 ±0.016，均低于模型組及安慰劑組，但均高于空白對照組，不同藥物劑量組間差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05)。

3 討論

視神經(jīng)損傷后，引起視功能下降的病理基礎(chǔ)是RGC 的繼發(fā)性損傷[3-4]。研究證實[5]，RGC 數(shù)目在視神經(jīng)軸斷后明顯下降。因此，保護RGC、促進RGC存活是TON發(fā)生后要解決的關(guān)鍵問題。本實驗也表明，視神經(jīng)夾挫傷后大鼠RGC大量丟失。

視神經(jīng)損傷后，RGC死亡是多途徑、多因素的。近年來越來越多的研究表明凋亡在TON發(fā)生后RGC的死亡機制中占重要地位，是各種視神經(jīng)病變導(dǎo)致視力不可逆轉(zhuǎn)的共同通路[6]。Quigley等[7]首次在靈長類動物的實驗中證明了視神經(jīng)損傷后RGC的凋亡。RGC發(fā)生凋亡主要是一種視神經(jīng)損傷后期(5～14 d)的繼發(fā)性改變，可能與軸索機械損傷后導(dǎo)致膜完整性破壞，軸漿運輸中斷所致營養(yǎng)因子缺乏以及缺血后神經(jīng)失去營養(yǎng)支持而觸發(fā)凋亡啟動程序有關(guān)。Bien等[8]通過實驗證明，視神經(jīng)損傷后7 d左右RGC凋亡達高峰，抑制外傷性視神經(jīng)損傷后早期凋亡程序的啟動，減少RGC的凋亡有助于急性視神經(jīng)病變的早期治療。

Figure 2 Retinal TUNEL staining(×400).A:Normal control group;B:Model group;C:PBS control group;D:Low-dose colivelin group;E:Mediumdose colivelin group;F:High-dose colivelin group 視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果。A:空白對照組;B:模型組;C:安慰劑組;D:Colivelin低劑量組;E:Colivelin中劑量組;F:Colivelin高劑量組(×400)

Figure 3 Immunohistochemical staining of caspase-3 in retina(×400).A:Normal control group;B:Model group;C:PBS control group;D:Low-dose colivelin group;E:Medium-dose colivelin group;F:High-dose colivelin group 視網(wǎng)膜caspase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。A:空白對照組;B:模型組;C:安慰劑組;D:Colivelin低劑量組;E:Colivelin中劑量組;F:Colivelin高劑量組(×400)

在諸多參與細胞凋亡發(fā)生的因素中，caspase家族介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程起著非常重要的作用，目前認為凋亡可能就是caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)切割底物的過程。盡管對于不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘發(fā)的凋亡過程中，參與的caspase有所不同，但caspase-3作為細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中的公共下游效應(yīng)分子而備受關(guān)注，它是家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，負責(zé)對全部或部分關(guān)鍵性蛋白的剪切，因此caspase-3是細胞進入程序性死亡的特異性標志[9]。本實驗通過建立外傷性視神經(jīng)損傷動物模型初步證明，Colivelin發(fā)揮抗凋亡作用是通過減少caspase-3表達來完成的。

目前國內(nèi)外對視神經(jīng)損傷的治療尚無統(tǒng)一標準，主要治療方法包括視神經(jīng)管減壓術(shù)及糖皮質(zhì)激素治療以解除對視神經(jīng)的壓迫、消除視神經(jīng)水腫。但國際視神經(jīng)外傷研究小組認為[10]，激素治療和視神經(jīng)管減壓術(shù)均不是治療TON的金標準。Mariak等[11]通過對患者3～11 a的臨床隨訪觀察也證實，通過上述方法的治療均不能有效阻止視神經(jīng)萎縮的發(fā)生。故而，尋找一種有效的、安全的新療法具有重要意義。近年來越來越多的文獻報道視神經(jīng)損傷后，RGC數(shù)量因凋亡而發(fā)生明顯減少，同時視神經(jīng)的再生修復(fù)也受到阻礙。因此，在視神經(jīng)損傷的治療中，減少RGC的凋亡及在此基礎(chǔ)上促進其軸突的再生成為目前研究的熱點[12]。Colivelin是一種新近合成的雜交肽，他是由ADNF-9和一種humanin衍生物組合而成。研究發(fā)現(xiàn)，該藥在治療神經(jīng)損傷方面有較好的效果。目前國內(nèi)外關(guān)于Colivelin的研究大多局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Chiba等[2]研究發(fā)現(xiàn)Colivelin在 100 fmol·L－1濃度下完全抑制了由 25 μmol·L－1Aβ1-43、V642I-APP 和 M146L-PS1 過表達所誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡，并在超過1 nmol·L－1的濃度水平仍然保持了它的神經(jīng)保護活性。Sari等[13]通過給予懷孕7 d母鼠以酒精流質(zhì)飲食的方法制作胎兒酒精暴露模型，證實腹腔注射Colivelin后可抑制腦細胞凋亡并促進神經(jīng)元的存活，具有明顯的神經(jīng)保護作用。但Colivelin在眼科保護RGC方面的研究尚未見報道，其在體內(nèi)是否對RGC具有保護作用，且保護作用是否呈劑量依賴性是值得深入探討的問題。

鑒于此，本實驗選擇不同劑量的Colivelin作用于外傷性視神經(jīng)損傷動物模型，采用HE染色法觀察RGC形態(tài)、計數(shù)RGC數(shù)，TUNEL染色法檢測RGC凋亡情況及免疫組織化學(xué)法測定caspase-3的表達，以此來研究Colivelin對夾挫傷后RGC存活的影響，并初步探討產(chǎn)生這一作用的機制。本實驗HE染色結(jié)果顯示模型組及安慰劑組較空白對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變薄，RGC核固縮，排列稀疏，RGC數(shù)目明顯減少。玻璃體內(nèi)注射不同劑量的Colivelin后，RGC數(shù)目隨劑量增加而增多。TUNEL染色結(jié)果顯示空白對照組未見凋亡細胞，大鼠夾挫傷后7 d凋亡細胞明顯增多，而Colivelin注射后凋亡細胞僅有少量增多，并且這種抑制作用具有明顯的劑量依賴性。另外，從caspase-3免疫組織化學(xué)結(jié)果中可見，視神經(jīng)夾挫傷后大鼠RGC的caspase-3表達增加，Colivelin能夠通過抑制caspase-3的表達而促進RGC存活，而且這種抑制作用同樣具有劑量依賴性。

綜上所述，視神經(jīng)夾挫傷后，大鼠玻璃體內(nèi)注射Colivelin，能有效抑制RGC的凋亡，減少RGC的丟失，降低caspase-3的表達，提示該藥的視神經(jīng)保護作用可能與抑制caspase-3的表達有關(guān)。這為臨床治療TON提供了新的思路。視神經(jīng)的損傷與修復(fù)是一個多環(huán)節(jié)、多因素的過程，而Colivelin對視神經(jīng)夾挫傷治療的機理及臨床應(yīng)用價值需要更廣泛的實驗來確立。

1 Swanson KI，Schlieve CR，Lieven CJ，Levin LA.Neuroprotective effect of sulfhydryl reduction in a rat optic never crush model[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(10):3737-3741.

2 Chiba T，Yamada M，Hashimoto Y，Sato M，Sasabe J，Kita Y，et al.Development of a femtomolar-acting humanin derivative named colivelin by attaching activity-dependent neurotrophic factor to its N-terminus:characterization of colivelin-mediated neuroprotection against Alzheimer’s disease-relevant insults in vitro and in vivo[J].J Neurosci，2005，25(44):10252-10261.

3 Steinapir KD，Goldberg RA.Traumatic optic neuropathy[J].Surv Ophthalmol，1994，38(6):487-518.

4 Slater BJ，Mehrabian Z，Guo Y，Hunter A，bernstein SL.Rodent anterior ischemic optic neuropathy(rAION)induces regional retinal ganglion cell apoptosis with a unique temporal pattern[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(8):3671-3676.

5 Levkovitch-Verbin H，Quigley HA，Martin KR，Zack DJ，Pease ME，Valenta DF.A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(8):3388-3393.

6 Agudo M，Perez-Marin MC，Lonngren U，Sobrado P，Conesa A，Canovas I，et al.Time course profiling of the retinal transcriptome after optic nerve transection and optic nerve crush[J].Mol Vis，2008，14:1050-1063.

7 Quigley HA，Nickells RW，Kerrigan LA，Pease ME，Thibault DJ，Zack DJ.Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36(5):774-786.

8 Bien A，Seidenbecher CI，Bockers TM，Sabel BA，Kreutz MR.Apoptotic versus necrotic characteristics of retinal ganglion cell death after partial optic never injury[J].J Neurotrauma，1999，16(2):153-163.

9 Sekiguchi M，Kobayashi H，Sekiguchi Y，Konno S，Kikuchi S.Sympathectomy reduces mechanical allodynia，tumor necrosis factor-alpha expression，and dorsal root ganglion apoptosis following nerve root crush injury[J].Spinec Phila Pa 1976，2008，33(11):1163-1169.

10 Singer CF，Kronsteiner N，Marton E，Walter I，Kubista M，Czerwenka K，et al.Interleukin-1 system and sex steroid receptor gene expression in human endometrial cancer[J].Gynecol Oncol，2002，85(3):423-430.

11 Mariak Z，Mariak Z，Obuchowska I，Stankiewicz A，Proniewska-Skreket E，Zalewska R.Remote results of conservative treatment of traumatic optic neuropathy[J].Neurol Neurochir Pol，1998，32(5):1165-1172.

12 秦懷宇，田 琳.視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細胞的凋亡及視神經(jīng)的再生與修復(fù)[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，6(4):157-159.

13 Sari Y，Chiba T，Yamada M，Rebec GV，Aiso S.A novel peptide，colivelin，prevents alocohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice:signaling pathway investigations[J].Neuroscience，2009，164(4):1653-1664.