昌艷萍,王曉茹，王宇，張子達，王華芳

(1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院， 北京 100083;2.河北大學 生命科學學院, 河北 保定 071002)

香花槐各組織總RNA提取方法的改良和優(yōu)化

昌艷萍1,2,王曉茹2，王宇2，張子達2，王華芳1

(1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院， 北京 100083;2.河北大學 生命科學學院, 河北 保定 071002)

為探索香花槐各組織總RNA提取的最佳方法，以實驗苗圃中的香花槐為實驗材料，在比較了Trizol試劑法和常規(guī)CTAB法的基礎(chǔ)上，建立了香花槐不同組織的最適提取方法.改良CTAB法利用高質(zhì)量濃度的β-巰基乙醇和合適質(zhì)量濃度的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)來防止RNA提取過程中多酚的氧化，然后增加苯酚/氯仿抽提次數(shù)來去除香花槐葉片和莖皮過多蛋白質(zhì).改良Trizol試劑法在根皮中加PVP研磨成白色粉末，可以有效地防止反應液褐化.各組織優(yōu)化方法經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，所提取的總RNA的28S、18S條帶清晰明亮，無降解；其A260 nm/A280 nm值為2.0，表明提取的總RNA質(zhì)量較好.

香花槐;多糖;多酚;總RNA; 組織

香花槐(Robiniapseudoacacia‘Idaho’)為豆科刺槐屬喬木樹種，20世紀60年代從西班牙引入朝鮮，1996年從朝鮮引入中國[1].香花槐速生，花紫紅色，總狀花序壯觀，開花時間5-7月，花期長；根系強健，萌蘗更新能力強，有根瘤菌，能固氮，耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿，喜沙質(zhì)土壤，并可有效地保持水土，改善生態(tài)環(huán)境.是城市綠化、美化、沙化及流域治理、荒山荒地生態(tài)修復的先鋒樹種[2].在基因水平上了解該樹種生長發(fā)育；開展遺傳轉(zhuǎn)化品種改良的研究已得到了重視.相關(guān)分子生物學和工程技術(shù)研究， cDNA文庫建立、Northern雜交分析或RT-PCR及表達差異分析等亟待高質(zhì)量的RNA[3].

植物組織總RNA提取方法的報道很多, 且Yoshida曾報道香花槐凝集素cDNA的克隆，這為香花槐不同組織RNA提取方法的建立和優(yōu)化提供了豐富資料[4].同時考慮到植物組織特異性，不同材料甚至同一材料不同發(fā)育階段，RNA的提取方法也不盡相同[5-7].本文以香花槐根、莖、葉等不同器官為試材，以Trizol法、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法為基礎(chǔ)，優(yōu)化和建立其RNA提取方法，為其分子生物學研究和生物工程技術(shù)需要奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1材料和試劑

1.1.1 材料

供試材料香花槐(Robiniapsuedoacacia‘Idaho’)采自北京林業(yè)大學生物中心苗圃.4-5月，植株萌芽生長，采集嫩葉、莖、根部皮層和幼嫩根尖，液氮冷卻，-80 ℃儲存?zhèn)溆?

1.1.2 主要試劑配制

焦碳酸二乙酯(DEPC)水:質(zhì)量濃度為1 g/L；CTAB裂解緩沖液；苯酚、氯仿、異戊醇以體積比25∶24∶1混合； 體積分數(shù)為75%的乙醇；LiCl 10 mol/L；SSTE溶解液(DEPC水配制).

1.1.3 實驗用品處理

實驗中所用的塑料制品在含質(zhì)量濃度為1 g/L的 DEPC水中，37 ℃浸泡12 h；玻璃器皿與用具均在180 ℃下烘烤12 h，然后121 ℃滅菌30 min，60 ℃烘干備用.

1.2提取方法

1.2.1 Trizol法

自Invitrogen公司購Trizol試劑，其RNA提取方法參照試劑說明書，得到的總RNA溶于適量的 DEPC水中.

1.2.2 改良Trizol法

考慮到植物組織中多酚類和多糖物質(zhì)的含量高，細胞破碎后極易被氧化成紅褐色物質(zhì)，與核酸不可逆地結(jié)合[8]干擾RNA提取，在上述Trizol法基礎(chǔ)上，在研磨幼嫩根皮過程中，加入質(zhì)量濃度為20 g/L的PVP，在抽提過程中加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇(體積比25∶24∶1)混合液進行抽提.

1.2.3 改良CTAB法

在徐進[9]方法基礎(chǔ)上，以幼嫩樹皮為實驗材料，針對香花槐組織本身蛋白質(zhì)含量高的特性[10]，對聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)最適質(zhì)量濃度、β-巰基乙醇以及用等體積的苯酚、氯仿、異戊醇(體積比25∶24∶1)混合液抽提去蛋白的次數(shù)進行了摸索，各比例設(shè)計見表1.

1.3 RNA完整性分析

從表1所述方法得到的RNA中取6 μL進行質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析.

1.4 RNA得率及純度

以微量分光光度計(SMA3000型)測量RNA樣品的OD230，OD260，OD280和RNA質(zhì)量濃度,以O(shè)D260/OD280，OD260/OD230檢測RNA純度.按照以下公式計算RNA產(chǎn)率，

產(chǎn)率=ρ×N×V/m,

ρ為樣品質(zhì)量濃度，單位為μg/mL,N為樣品稀釋倍數(shù),V為樣品體積，單位為mL,m為樣品質(zhì)量，單位為g.

本實驗用相同質(zhì)量的組織為研究對象，同時提取后的RNA溶解于相同體積的DEPC水中，因此，樣品質(zhì)量濃度的大小就反應了各組織材料的產(chǎn)率大小.

表1 香花槐總RNA提取方法

2 結(jié)果與分析

2.1 2種Trizol法提取RNA的比較

RNA的完整性：總RNA的主要成分是28S RNA和18S RNA，因此，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖上28S和18S RNA的完整性可以判斷RNA有無降解及有無DNA污染.圖1顯示，Trizol法提取的總RNA樣品有條帶的只有根組織，18S rRNA條帶亮度與28S rRNA 幾乎一致， 28S rRNA條帶亮度為18S rRNA條帶亮度2倍的狀況沒有呈現(xiàn)出；莖和葉片提取的總RNA無清晰條帶出現(xiàn)，而點樣孔周圍亮，可能有大片段DNA污染；該方法不適合用于提取香花槐RNA.

改良Trizol法，在根皮中加入PVP研磨，粉末白色，有效防止褐化(圖2).由于Trizol試劑中含有強氧化劑苯酚，能將根皮組織中的多酚類物質(zhì)氧化，從而發(fā)生褐化效應[11].在本研究中發(fā)現(xiàn)Trizol法1次并不能非常完整有效地去除細胞中的蛋白質(zhì).為了將多糖和蛋白成分更徹底地去除，增加了在抽提過程中加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇(體積比25∶24∶1)混合液，28S和18S條帶均清晰可見，且條帶明亮，28S條帶的亮度約是18S條帶的2倍，說明提取的RNA無降解，質(zhì)量好，且無DNA污染(圖3).圖2表明，常規(guī)Trizol法提取的根組織總RNA樣品，在瓊脂糖凝膠電泳點樣孔附近顯示明亮條帶，說明有大分子蛋白或DNA污染.與此相比，改良Trizol法去除了根皮總RNA提取的干擾，提取效率高，為香花槐根皮總RNA提取的首選方法.

1,2.根皮；3,4.枝皮；5,6.葉片.

1.加PVP裂解粗提物；2.不加PVP裂解粗提物.

2.2提取香花槐RNA的改良CTAB法

本實驗著重以幼嫩葉片為實驗材料對CTAB法進行了改良.紫外分光光度計測定不同處理方法提取的總RNA進行比較，結(jié)果見表2、表3.表2、表3顯示當PVP質(zhì)量濃度為20 g/L時，RNA的平均產(chǎn)率為243.25 μg/mL，顯著高于質(zhì)量濃度為40, 80 g/L時的產(chǎn)率209.25，174.67 μg/mL， PVP質(zhì)量濃度升高時，RNA純度逐漸增高，但RNA產(chǎn)率卻開始下降，說明在PVP去除多酚等雜質(zhì)時也結(jié)合RNA使其丟失了，但其OD260/OD230和OD260/OD280的比率都在2.0左右.PVP與酚類化合物(特別是原花色素類物質(zhì))能形成鰲合物，使之不能成為多酚氧化酶的底物而阻止它們的氧化.3種不同質(zhì)量濃度的PVP所獲得的第1次抽提產(chǎn)物的顏色比較見圖4.圖4結(jié)果表明，PVP可以有效地防止底物的褐化，結(jié)合表2可知，PVP的質(zhì)量濃度在20 g/L時無論是RNA產(chǎn)率，還是OD260/OD230和OD260/OD280的比率都是最理想的.如果在能保證RNA質(zhì)量的前提下，適當降低PVP的質(zhì)量濃度，認為20 g/L即可作為PVP的適宜質(zhì)量濃度.40 g/L和20 g/Lβ-巰基乙醇2個處理中RNA產(chǎn)率變化不顯著，但40 g/L處理可明顯提高RNA的純度，所以認為40 g/L為β-巰基乙醇作用的最適質(zhì)量濃度.

1.20 g/L PVP；2.40 g/L PVP ；3.80 g/L PVP.

表2 不同組合提取RNA的結(jié)果比較

表3 不同組合提取RNA的平均純度、產(chǎn)率及其差異顯著性

據(jù)測定，香花槐莖葉中分別含粗蛋白21%～25%，是一種速生、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的木本飼料[10].在提取的過程中應該加強對蛋白的去除，防止蛋白對下游工作的影響，因此本實驗選用增加抽提次數(shù)來比較蛋白的去除，結(jié)果如圖5和表2.表2顯示隨著抽提次數(shù)的增加RNA含量會有所降低，但其OD260/OD230和 OD260/OD280的比率是越來越理想(2.0左右)，圖5也表明不同抽提次數(shù)的離心產(chǎn)物也顯示越來越透明澄清.考慮到RNA的得率及其OD260/OD230和 OD260/OD280的比率，選擇2次為最適的抽提次數(shù).

對香花槐而言，綜合以上結(jié)果，改良CTAB法的最適提取液組成為 4 mol/L異硫酸氰胍，20 g/L CTAB, 20 mmol/L EDTA(pH 8.0), 100 mmol /L Tris-HCl ( pH 8.0 )，質(zhì)量濃度為40 g/L的β-巰基乙醇和20 g/L PVP，在抽提過程中選擇抽提2次，在以下香花槐莖皮和葉片組織的改良CTAB法中均采用此方法.

2.3不同組織的RNA提取方法比較

以改良的Trizol法提取香花槐根皮，以改良CTAB法提取香花槐葉片和莖皮結(jié)果如圖6.圖6顯示提取的RNA 28S條帶的亮度約是18S條帶的2倍，多酚、蛋白及多糖類等雜質(zhì)污染較少， 符合后續(xù)分子生物學的實驗要求.

1.抽提1次 ；2.抽提2次 ；3.抽提3次.

M.Mark；1.改良Trizol試劑法提取根皮;2，3.改良CTAB法分別提取的葉片和莖皮.

圖6不同方法提取香花槐不同器官與組織的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.6AgarosegelelectrophoresisoftotalRNAisolatedfromdifferenttissuesororganswithdifferentmethods

3 討論

不同植物，即使同一植物不同組織的組成差別較大，所以對于不同植物或同一植物不同組織的RNA提取方法也應該有所不同[5].

3.1 RNA提取需要注意的問題

實驗過程中要嚴格控制無酶的環(huán)境，操作人員要帶一次性手套和口罩，整個過程盡量在超凈臺工作，提前用紫外燈照射消毒超凈臺30 min，所用試劑都需要滅酶處理，以減少RNase的污染.要用液氮徹底研磨，否則影響細胞的完全破裂，提出的RNA量少或根本提不出.特別在本實驗中比較堅硬的根皮組織可以事先在液氮中冷凍2 h以上再研磨.

3.2防止酚類氧化

在整個RNA提取過程中十分容易氧化，這是由于香花槐等植物類含有大量酚類化合物，導致各組織提取過程中顏色逐漸加深變褐，為解決酚類氧化問題，可以用β-巰基乙醇作為還原劑[13]，提高RNA的質(zhì)量的同時用PVP作鰲合劑，減輕氧化而產(chǎn)生的背景顏色.

3.3克服蛋白質(zhì)污染

考慮到香花槐尤以莖葉組織中含有大量的蛋白，這樣在提取緩沖液中加入如鹽酸呱、異硫酸氰胍、巰基乙醇及CTAB等蛋白質(zhì)變性劑，使蛋白質(zhì)變性完全，細胞裂解徹底，從而將RNA完全釋放出來，同時可去除大部分蛋白質(zhì)，最后再用苯酚/氯仿多次抽提除去殘存的蛋白質(zhì)和DNA.

經(jīng)過上述改良的CTAB法、Trizol試劑法產(chǎn)率和質(zhì)量均有顯著改善，且在香花槐的不同材料組織中具有較好的適用性.即使方法適宜，實驗材料也會很大程度限制RNA的提取，應根據(jù)操作者實驗具體要求選擇適宜的材料，從而達到最佳效果.本實驗于4月中旬，以香花槐幼嫩組織為試材提取RNA，產(chǎn)率和質(zhì)量均較高.

[1] JUNFAR.香花槐[EB/OL].(2005-10-05).[2006-01-20].http://www.landscape66.com/plant/ahiwu/200510/3526.html.

JUNFAR.Robiniapseudoacacia'Idaho'[EB/OL].(2005-10-05).[2006-01-20].http://www.landscape66.com/plant/ahiwu/200510/3526.html

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(責任編輯：趙藏賞)

EfficientimprovedmethodsforisolationofhighqualitytotalRNAfromdifferenttissuesofRobiniapseudoacacia‘Idaho’

CHANGYan-ping1,2,WANGXiao-ru2,WANGYu2,ZHANGZi-da2,WANGHua-fang1

(1.College of Biological Science and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China; 2.College of Life Sciences, Hebei University,Baoding 071002,China)

To search for the best methods, the different organs ofRobiniapseudoacacia‘Idaho’ were used as materials to establish the improved methods for isolation of total RNA by comparing Trizol method and CTAB method.An improved CTAB method which can use the high concentrationβ-mercaptoethanol and 20 g/L PVP to eliminate the interferences of polysacchrides and the further phenol/chloroform extraction to eliminate the interferences of proteins of the leaf blade and stem ofR.pseudoacacia‘Idaho’ was constructed in this study.The reaction solution could effectively prevent to brown by adding PVP in the root bark in the improved Trizol method.The optimized methods of each organ ofR.pseudoacacia‘Idaho’ showed that 28S and 18S RNA bands were clearly visible and theA260 nm/A280 nmratio of the isolated total RNA was 2.0, and which indicated that the total RNA quality was satisfying.

Robiniapseudoacacia‘Idaho’;polysacchrides; polyphenols; RNA extraction; tissues

Q52

A

1000-1565(2012)01-0075-06

2011-10-12

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項項目(200704017)

昌艷萍(1969-)，女，湖北仙桃人，河北大學副教授,北京林業(yè)大學在讀博士研究生,主要從事生物技術(shù)研究.

王華芳(1956-),男,云南石屏人，北京林業(yè)大學教授,博士生導師,主要從事植物生物技術(shù)方面的研究.

E-mail:hfwang.163@163.com