張 潔 白 娟 李成網(wǎng)*

（安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061）

通脈抗栓顆粒是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)的六類中藥新藥，已獲國家藥品食品監(jiān)督管理局頒發(fā)的臨床批件（批件號(hào)：2007L05140），由當(dāng)歸、川芎、葛根、人參葉等中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血通脈等功效。用于腦血栓癥見頭暈?zāi)垦?，頭痛，肢體麻木或強(qiáng)急，氣短乏力，便干便秘，口干口渴，舌質(zhì)紅或質(zhì)暗淡等氣陰兩虛, 瘀阻腦絡(luò)證。采用薄層色譜法對(duì)其中的當(dāng)歸、川芎、麥冬、人參葉進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)葛根中的有效成分葛根素進(jìn)行含量測定，可有效控制通脈抗栓顆粒的質(zhì)量。

1 儀器、試藥與樣品

Waters 600型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UV 996型紫外檢測器；AD-2型百萬分之一電子天平（美國PE公司）；BP210S型萬分之一電子天平（德國賽多利斯）；AS3120型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯）；葛根素為對(duì)照品（批號(hào)0752-9806供含量測定用）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)704—8903）；人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)754-9002）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)0703-200119）；當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)120927-200310）；川芎對(duì)照藥材（批號(hào)120918-200306）；麥冬對(duì)照藥材（批號(hào)121013-200607）均購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、磷酸為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為化學(xué)純。通脈抗栓顆粒由安徽省華康醫(yī)藥科技開發(fā)有限責(zé)任公司提供（規(guī)格：每袋裝8g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當(dāng)歸川芎的鑒別[1]

取本品15g，研細(xì)，加乙醚150ml浸漬1h后，超聲處理5min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴?.5mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材和川芎對(duì)照藥材各1g，分別加乙醚50mL，浸泡1h，超聲處理5min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴?mL使溶解，分別作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取當(dāng)歸和川芎對(duì)照藥材溶液3μL，供試品溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正已烷-醋酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯兩個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖1。

圖1 當(dāng)歸川芎鑒別薄層色譜圖

2.1.2 麥冬的鑒別[2]

取鑒別（1）項(xiàng)下乙醚提取后的藥渣，加乙醇100mL回流1h，濾過，濾液回收乙醇至干，加3%硫酸溶液10mL置沸水浴加熱回流2h，用3%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，水浴蒸干，殘?jiān)勇确?mL使溶解，作為供試品溶液，另取麥冬對(duì)照藥材2g，加乙醇20mL回流1h，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液10μL和供試品溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸溶液，于105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖2。

2.1.3 人參葉的鑒別[3,4]

圖2 麥冬鑒別薄層色譜圖

取本品5g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5mL使溶解，濾過，濾液加水飽和正丁醇提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的氨試液洗3次，每次25mL，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rb1、Re、Rg1對(duì)照品，分別加甲醇制成每1mL各含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液5～10μL，對(duì)照品溶液3～5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水（4∶1∶5）的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至色斑清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖3。

圖3 人參葉鑒別薄層色譜圖

2.2 葛根素的含量測定

葛根為方中君藥，其主要成分為葛根素。用高效液相色譜法測定中藥制劑中葛根素的含量的報(bào)道很多[5,6]。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，為了有效地控制本品的質(zhì)量，建立了本品的葛根素的高效液相色譜法的測定法，經(jīng)方法學(xué)考察，本法簡便、準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可有效控制本品質(zhì)量，其方法學(xué)考察如下：

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取葛根素對(duì)照品適量，加30%乙醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)（過4號(hào)篩），取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備

取缺葛根的陰性制劑，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法依法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.1.4 色譜條件的選擇

色譜柱：Shim-Pack CLC ODS柱（150×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min。在此條件下，葛根素與其它成分均能很好地分離，供試品中葛根素保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 對(duì)照品、樣品、陰性樣品HPLC色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取葛根素對(duì)照品溶液（0.21744mg/mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置10mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取20μL，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，峰面積分別為：1516068、2931786、4409670、5889355、7336747。以葛根素的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算，得線性回歸方程為：A=67140C+37047 r=0.99997（n=5）。表明葛根素在21.744～108.72μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 供試品精密度試驗(yàn)

取按供試品溶液制備法制備的供試液（批號(hào)040805），按上述色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄葛根素峰面積分別為:5179674、5275425、 5276877、5392464、5317029，RSD=1.46%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將按供試品溶液制備法制備的供試液（批號(hào)040805）于0、1、2、4、6、8h按上述色譜條件重復(fù)測定一次，記錄葛根素峰面積分別為:5463520、5417945、5489535、5464131、5471071、5561982，RSD=0.87%。表明供試液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)040805）共5份，按供試品溶液制備法制備供試液，精密量取該溶液和對(duì)照品溶液各20mL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算葛根素含量分別為65.5728mg/袋，65.7864mg/袋，64.1368mg/袋，65.0384mg/袋，64.9488mg/袋，RSD=0.98%。表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量（65.0968mg/袋）的樣品適量，分別精密加入葛根素對(duì)照品適量，按正文含量測定項(xiàng)下的方法依法制備供試品溶液并測定，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.10 樣品測定

對(duì)3批中試樣品按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液各20mL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 本方為中藥復(fù)方制劑，采用薄層色譜鑒別方法對(duì)方中的每一味中藥均進(jìn)行了鑒別，并進(jìn)行了陰性對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果其方法簡便且專屬性強(qiáng)，可有效控制本品的質(zhì)量。

3.2 關(guān)于葛根中葛根素的含量測定方法，文獻(xiàn)報(bào)道很多，但在本制劑中未見報(bào)道，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了選擇，先后比較了甲醇-水（25∶75）、甲醇-水（22∶78）、甲醇-0.1%磷酸溶液（22∶78）、甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）。結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）為流動(dòng)相最佳。

3.3 對(duì)供試品溶液制備的超聲提取時(shí)間也做了考察，分別比較了超聲處理10、20、30、40min的效果。結(jié)果表明，超聲提取30min已能提取完全，因此超聲提取時(shí)間選擇30min為佳。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:433.

[2]余伯陽.不同麥冬假葉樹皂甙元的含量比較[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1987,18(2):117.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:6.

[4]苗明三,李振國.現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:36.

[5]楊小平.RP-HPLC法測定感冒清熱顆粒中葛根素的含量[J].藥物分析雜志 2001,21(5):331.

[6]劉建峰.HPLC法測定舒心片中葛根素含量[J].西北藥學(xué)雜志,2000,15(5):1990.