韋松基* 薛亞馨 王小新 韋 威

（廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001）

貓豆為豆科植物龍爪黎豆Mucuna pruriens （L.）DC.var.utilis（Wall.ex Wight）Bak.ex Burck[Stizolobium cochinchinensis （Lour.）Tang et Wang]的種子，在我國南方地區(qū)有豐富的資源，其主要成分為左旋多巴[1]。研究表明，左旋多巴是治療帕金森病的主要用藥[2]。貓豆為廣西地方習(xí)用藥材，尚未收載于藥材標(biāo)準(zhǔn)。此次擬收載于《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）》，本文通過實(shí)驗(yàn)考察了貓豆中左旋多巴的顯微鑒別，薄層鑒別，含量測定及一些理化指標(biāo)檢驗(yàn)，制定出了貓豆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CH20生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；日本島津LC-10AT型高效液相色譜儀、島津SPD-10Avp紫外檢測器、威瑪龍色譜工作站、進(jìn)樣針：Hamilton 25μl進(jìn)樣針、SB2200-T型超聲儀、GB11240-89型電熱恒溫水浴鍋、Metler AM100型電子分析天平、Sartorius BT125D電子天平、Millipore simplicity-185超純水器（美國密理博公司）。

1.2 試藥

左旋多巴對照品（中國藥品生物制劑品檢定所提供，批號0170-9302，供含量測定）；乙腈（天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；色譜純）、甲醇（天津康巢科技開發(fā)有限公司；色譜純）、冰醋酸（成都科龍化工試劑廠；分析純）、磷酸（西隴化工股份有限公司；色譜純）；薄層層析硅膠（化學(xué)純，青島海洋化工有限公司，批號0100616）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀

本品為扁橢圓形或腎形，長約1.4cm，寬約1cm，厚約6mm。表面灰白色，微皺縮，略具光澤，邊緣有白色種臍，長約6mm，寬約1.5mm，種臍上有類自色膜片狀種阜殘留。質(zhì)堅(jiān)硬。種皮薄而脆。氣微，味淡，嚼之有豆腥氣。

2.2 粉末鑒別

粉末白色。淀粉粒大量存在，多為單粒，直徑28～134μm，貝殼形或橢圓形，臍點(diǎn)點(diǎn)狀，層紋明顯；臍點(diǎn)處?？梢姴灰?guī)則裂縫。表皮細(xì)胞柵欄狀，排列緊密，長110～285μm，直徑15～35μm；頂面觀蜂窩狀，細(xì)胞為5～7邊形，壁極厚。支持細(xì)胞啞鈴形或骨狀，常形成縊縮，長60～235μm，直徑25～80μm；頂面觀類圓形不規(guī)則狀，壁厚，胞腔明顯。子葉細(xì)胞多見，細(xì)胞多邊形，含有大量糊粉粒及油滴；?？梢娚⒃诘暮哿Ｅc油滴。

2.3 水分、總灰分、酸不溶灰分及浸出物的測定

2.3.1 測定方法

水分測定參照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ H第一法測定；總灰分及酸不溶灰分參照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅸ K測定；浸出物參照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅹ A測定，分別以水、乙醇、稀乙醇為溶劑，采用冷浸法及熱浸法測定本品浸出物的含量。

2.3.2 測定結(jié)果

10批貓豆藥材的水分、總灰分、酸不溶灰分及浸出物的測定結(jié)果的平均值分別：水分12.51%，總灰分2.89%，酸不溶灰分0.18%；水熱浸出物34.13%，乙醇冷浸出物7.52%，乙醇熱浸出物9.08%，稀乙醇冷浸出物17.84%，稀乙醇熱浸出物21.37%。綜合考慮各因素的影響，建議貓豆水分不得過14.5%，總灰分不得過3.6%，酸不溶灰分不得超過0.3%，浸出物以水為溶劑，熱浸法測定，浸出物不得少于25%。

2.4 貓豆中左旋多巴的薄層鑒別

取本品粉末2g，于 0.1mol/L HCl溶液中冷浸 12h，不時(shí)振搖，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取對照藥材2g同法制成對照藥材溶液。取左旋多巴對照品2.52mg，加0.1mol/L鹽酸制成每1mL含0.6mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VI B）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（2∶1∶1）為展開劑，預(yù)平衡15min，展開，取出，晾干，噴以0.5%茚三酮乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 貓豆藥材薄層色譜圖（T：30 ℃，RH：51%）

2.5 貓豆中左旋多巴的含量測定

2.5.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1mol/L冰醋酸溶液-甲醇（95：5）為流動(dòng)相；檢測波長：280nm。理論板數(shù)按左旋多巴峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。HPLC色譜圖見圖2。

2.5.2 對照品溶液制備

精密稱取左旋多巴對照品適量，加0.1mol/L鹽酸溶解制成每1mL約含0.51mg的溶液，即得。

圖2 貓豆藥材HPLC圖

2.5.3 供試品溶液的制備

將本品藥材粉碎，過二號篩，稱取過二號篩的藥材約2g，精密稱定，置50mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液振搖后冷浸24h，定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液2.5mL置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，用0.1mol/L鹽酸溶液定容至10mL，搖勻，制成濃度為25.4、50.8、76.2、101.6、127.0、152.4μg/mL的一系列對照品溶液，然后依法操作，分別進(jìn)樣20μL，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸收峰峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=9844.65X-10872.13，r=0.9997（n=6）。結(jié)果表明左旋多巴進(jìn)樣濃度在25.4～152.4μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積積分值之間呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對照品試液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得芒果苷峰面積分值，RSD為0.61%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取對照品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，測得左旋多巴峰面積，RSD為0.72%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取左旋多巴對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μl，測定左旋多巴含量，6次測定的RSD為1.88%，表明重現(xiàn)性良好。

2.5.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法，取同一批號樣品9份，每份約0.2g，精密稱定，再分別精密加入左旋多巴對照品，制備供試品溶液，測定并計(jì)算左旋多巴的含量，結(jié)果見表1，回收率符合要求。

2.5.9 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中左旋多巴的含量。測定結(jié)果見表2。

考慮到不同產(chǎn)地的藥材中左旋多巴含量不一，以及在平時(shí)放置、實(shí)驗(yàn)過程中操作等引起的損失，故將貓豆中左旋多巴含量的限度適當(dāng)降低，將本品的含量限度確定為：本品按干燥品計(jì)算，含左旋多巴不得低于4.05%

表1 左旋多巴加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表2 貓豆中左旋多巴的含量測定

3 小結(jié)與討論

在進(jìn)行貓豆中左旋多巴的薄層鑒別時(shí)，試過環(huán)己烷-三氯甲烷-無水乙醇（7∶3∶1）、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）、正丁醇-冰醋酸-水（2∶1∶1）展開系統(tǒng)，并考查過1μL、2μL、3μL、5μL的點(diǎn)樣量。結(jié)果以正丁醇-冰醋酸-水（2∶1∶1）為展開系統(tǒng)，硅膠G薄層板，點(diǎn)樣量為2μL，預(yù)平衡15min，噴以0.5%茚三酮乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，所得薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好，易判斷結(jié)果。

根據(jù)左旋多巴其可溶于稀酸的性質(zhì)，以0.1mol/L鹽酸為溶液，其紫外最大吸收峰為280nm（0.1mol/L鹽酸為溶劑），故以此作為HPLC測定波長。

本實(shí)驗(yàn)中測得貓豆含左旋多巴相對較高，而左旋多巴為治療帕金森病的主要用藥，通過制定貓豆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范貓豆的生產(chǎn)、使用，更有效、充分利用資源，為貓豆藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)并奠定臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。

[1]蔡軍,朱兆儀,劉永灌.黑皮類型狗爪豆的化學(xué)成分研究[J].植物學(xué)報(bào)-英文版,1990,32(7):574.

[2]陳其龍,徐美華,董文心.帕金森病治療藥物的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].世界臨床藥物,2011,32(6):324-328.