湯志剛 鄭浩 黃強(qiáng) 陳炯

·論著·

5-氮雜-2′-脫氧胞苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC1的組織因子途徑抑制物-2表達(dá)及CpG島甲基化的影響

湯志剛 鄭浩 黃強(qiáng) 陳炯

目的探討甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對(duì)胰腺癌細(xì)胞系PANC1的抑癌基因組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2)甲基化水平及基因表達(dá)的影響。方法應(yīng)用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理胰腺癌細(xì)胞系PANC1。用甲基化特異性PCR(MSP)、RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果未經(jīng)5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞的TFPI-2基因CpG島為完全甲基化，無TFPI-2 mRNA及蛋白的表達(dá)。1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理后，PANC1細(xì)胞的TFPI-2基因CpG島甲基化逆轉(zhuǎn)，從不完全甲基化到完全非甲基化； TFPI-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017；TFPI-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124，呈劑量依賴性增加(P<0.05)。結(jié)論胰腺癌細(xì)胞系PANC1的TFPI-2啟動(dòng)子高甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能夠逆轉(zhuǎn)其高甲基化狀態(tài)，并誘導(dǎo)TFPI-2 mRNA及蛋白重新表達(dá)。

胰腺腫瘤； 甲基化； 組織因子途徑抑制物2； 5-氮雜-2′-脫氧胞苷

胰腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多個(gè)抑癌基因的異常改變，而抑癌基因的失活又涉及多種途徑。其中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化被認(rèn)為是導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默甚至失活的主要原因之一[1]。人類組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)，又名胎盤蛋白-5，是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。它能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，抑制腫瘤新生血管的生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而在抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等一系列生理病理過程中發(fā)揮重要的作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1，觀察TFPI-2 mRNA、蛋白表達(dá)的變化及基因的甲基化狀態(tài)改變，探討胰腺癌的發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

一、DNA抽提

胰腺癌PANC1細(xì)胞系購自南京凱基生物公司，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。1例正常胰腺組織取自安徽省立醫(yī)院普外科膽胰病區(qū)外傷剖腹探查者，征得患者及家屬同意，作為陰性對(duì)照。5-Aza-dC購自MERCK公司。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，應(yīng)用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理PANC1細(xì)胞4 d，以未經(jīng)5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞作為對(duì)照。采用DNA抽取試劑盒(天根公司)提取細(xì)胞及組織DNA。

二、甲基化特異性PCR(MSP)

取1 μg DNA，使用DNA修飾試劑盒(EPIGENTEK公司)進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)MSP引物，甲基化引物上游5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′，下游5′-ACGACC-CGCTAAACAAAACG-3′；非甲基化引物上游5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′，下游5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 20 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

三、RT-PCR

取上述各組細(xì)胞及正常胰腺組織，用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。TFPI-2引物上游5′-CAGAATTCTATGGACCCCGCTCGCCCC-3′，下游5′-CAGTCG-ACTTAAAATTGCTTCTTCCG-3′。以β-actin作為內(nèi)參照。先逆轉(zhuǎn)錄cDNA，再行PCR，反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的基因條帶與β-actin條帶吸光值比值作為TFPI-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

四、蛋白質(zhì)印跡法

取上述各組細(xì)胞及正常胰腺組織，采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解30 min。4℃離心取上清液，Bradford法行蛋白定量后再行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TFPI-2蛋白。TFPI-2單抗(Santa Cruz公司)工作濃度1∶500，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG工作濃度1∶10000，最后ECL發(fā)光。以目的基因條帶與β-actin條帶吸光值比值作為TFPI-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、PANC1細(xì)胞TFPI-2基因甲基化狀態(tài)

對(duì)照組細(xì)胞只有甲基化引物擴(kuò)增出條帶，為完全甲基化；1×10-7、5×10-7mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞甲基化及非甲基化引物均擴(kuò)增出條帶，為不完全甲基化；1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞只有非甲基化引物擴(kuò)增出條帶，為非甲基化(圖1)。

M:甲基化產(chǎn)物;U:非甲基化產(chǎn)物

圖1空白對(duì)照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細(xì)胞(3)及經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞(4～6)的TFPI-2基因甲基化狀態(tài)

二、各組PANC1細(xì)胞TFPI-2 mRNA表達(dá)

PANC1細(xì)胞不表達(dá)TFPI-2 mRNA；1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理后的PANC1細(xì)胞均表達(dá)TFPI-2 mRNA(圖2)，相對(duì)表達(dá)量分別為0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017,兩兩濃度組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039、0.044)。

三、各組PANC1細(xì)胞TFPI-2蛋白表達(dá)

PANC1細(xì)胞不表達(dá)TFPI-2蛋白；1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理后的PANC1細(xì)胞均表達(dá)TFPI-2蛋白(圖3)，相對(duì)表達(dá)量分別為0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124，兩兩濃度組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006、0.045)。

圖2空白對(duì)照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細(xì)胞(3)及經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞(4～6)的TFPI-2 mRNA表達(dá)

圖3空白對(duì)照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細(xì)胞(3)及經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞(4～6)的TFPI-2 蛋白表達(dá)

討 論

已經(jīng)有研究證實(shí)，在多種腫瘤中TFPI-2的表達(dá)明顯減弱，甚至失活[4-9]。而導(dǎo)致該基因失活的主要原因可能是CpG島啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的狀態(tài)。5-Aza-dC作為一種甲基化酶抑制劑，能與DNA甲基化酶共價(jià)結(jié)合，抑制該酶的甲基化轉(zhuǎn)移活性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的基因甲基化，恢復(fù)mRNA轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，未經(jīng)5-Aza-dC 處理的PANC1細(xì)胞TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)為完全甲基化狀態(tài)。經(jīng)不同濃度5-Aza-dC處理后，細(xì)胞的TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)得到了不同程度的逆轉(zhuǎn)，TFPI-2 mRNA及蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性地重新表達(dá)，表明該藥物確能逆轉(zhuǎn)基因異常的高甲基化狀態(tài)，并通過啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的降低而恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

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Effectof5-Aza-dConthemethylationandexpressionofTFPI-2geneinpancreaticcancerPANC1cellline

TANGZhi-gang,ZHENGHao,HUANGQiang,CHENJiong.
DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China

TANGZhi-gang,Email:tangzg7031@163.com

ObjectivesTo investigate the effects of 5-aza-2-deoxycytidine(5-Aza-dC), a methylation inhibitor, on the expression and methylation of tissue factor pathway Inhibitor (TFPI-2) gene in PANC1 cell line of pancreatic cancer.MethodsPANC1 cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC (1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L). The status of TFPI-2 methylation and expressions of TFPI-2 mRNA and protein were determined by MSP, RT-PCR, and Western blot.ResultsTFPI-2 gene CpG island was completely methylated, and there was no expression of TFPI-2 mRNA and protein without 5-Aza-dC treatment. After treatment with different dosages of 5-Aza-dC(1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L), TFPI-2 gene CpG hypermethylation was reversed from incomplete methylated to complete non-methylated. The relative expressions of TFPI-2 mRNA were 0.211±0.087, 0.327±0.068, 0.609±0.017; and the relative expressions of TFPI-2 protein were 0.429±0.121, 0.675±0.044, 1.132±0.124 in a dose-dependent manner (P<0.05).ConclusionsThe hypermethylation of promoter region may be the primary reason for TFPI-2 gene expression down-regulation and inactivation. 5-Aza-dC may reverse the hypermethylation of TFPI-2 gene, and induce the re-expression of TFPI-2 mRNA and protein.

Pancreatic neoplasms; Methylation; Tissue factor pathway inhibitor 2; 5-Aza-dC

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.006

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071734)

230001 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科

湯志剛，Email:tangzg7031@163.com

2011-05-27)

(本文編輯：呂芳萍)