夏偉 王洛偉 高軍 黃玲 李兆申

·論著·

Hedgehog通路蛋白在慢性胰腺炎大鼠中的表達(dá)

夏偉 王洛偉 高軍 黃玲 李兆申

目的檢測慢性胰腺炎(CP)組織中hedgehog信號通路相關(guān)蛋白Ptch、Smo和Gli 1的表達(dá),探討其意義。方法60只SD大鼠按數(shù)字表法隨機分為CP組(50只)和對照組(10只)。經(jīng)尾靜脈注射二丁基二氯基錫(DBTC)溶液8 mg·ml-1·kg-1方法制備CP模型；對照組尾靜脈注射100%乙醇和甘油配制成的有機溶劑1 ml/kg體重。6周后處死動物，取胰腺組織常規(guī)病理檢查，Sirius red染色測定膠原含量，免疫組化和RT-PCR法檢測Ptch、Smo、Gli 1蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果制模后6周34只大鼠發(fā)展為CP，制模成功率為73.9%(34/46)。CP大鼠膠原含量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(38.52±6.49)%比(7.37±2.28)%，P<0.05]；Ptch、Smo、Gli 1蛋白陽性表達(dá)率分別為73.5%、64.7%和52.9%；Ptch、Smo、Gli1 mRNA表達(dá)量分別為2.38±0.42、3.85±1.03、4.63±1.49，均顯著高于對照組的蛋白無表達(dá)及mRNA的表達(dá)(0.23±0.16、0.14±0.05、0.57±0.12，P值均<0.05)。結(jié)論CP組大鼠胰腺組織Ptch、Smo、Gli11均呈高表達(dá)，表明hedgehog信號通路參與胰腺慢性炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。

慢性胰腺炎； Hedgehog信號通路； 免疫組織化學(xué)

慢性胰腺炎(CP)的特征性改變是胰腺持續(xù)性炎癥反應(yīng)引起形態(tài)學(xué)上不可逆的纖維化和胰管狹窄或擴張，導(dǎo)致胰腺內(nèi)外分泌功能不全。其發(fā)病機制包括氧化應(yīng)激、中毒-代謝、導(dǎo)管梗阻和壞死-纖維化等理論[1]。hedgehog信號通路調(diào)節(jié)人類胚胎發(fā)育過程，主要由膜受體Ptch、Smo和核轉(zhuǎn)錄因子Gli等組成。它在包括胰腺癌等許多惡性腫瘤中異常表達(dá)[2-3]，但在CP發(fā)生中的作用罕見報道。本研究檢測CP大鼠胰腺組織中hedgehog信號通路成員的表達(dá)，探討該通路在CP發(fā)生過程中的作用。

材料與方法

一、動物模型及分組

60只SD大鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供,體重190～210 g,雌雄不限,按數(shù)字表法隨機分成CP組(50)和對照組(10只)。參考文獻(xiàn)[4]，采用尾靜脈注射由80 mg二丁基二氯基錫(DBTC)(Sigma公司)、4 ml 100%乙醇和6 ml甘油配制成的DBTC溶液8 mg·ml-1·kg-1體重的方法制備CP模型；對照組尾靜脈注射等容積乙醇甘油液。6周后處死大鼠，取胰腺組織，部分置液氮保存，部分置10%中性甲醛液固定。

二、胰腺組織病理檢查及Sirius red 染色

取固定的胰腺組織，常規(guī)病理檢查。另取切片行Sirius red(Sigma公司)染色，光鏡下觀察3個高倍視野，應(yīng)用Motic Images Advanced3.2圖像分析系統(tǒng)測定Sirius red陽性染色面積(%)[5]。

三、Ptch、Smo、Gli1蛋白檢測

采用免疫組化SP法,按試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書操作。山羊抗鼠Ptch、Gli多抗購自Santacruz公司；兔抗鼠Smo多抗購自Abcam公司。用已知陽性的前列腺癌作為陽性對照,PBS代替一抗作陰性對照。由兩名病理科醫(yī)師盲法閱片。以胞膜、胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。每例切片選取5個高倍視野,計數(shù)1000個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級[6]：無陽性細(xì)胞者0分,<25% 1分,25%～75% 2分,>75% 3分；不顯色或顯色不清為0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。兩分相加,0～1分為陰性 ,2為以上為陽性。

四、Ptch、Smo、Gli1 mRNA檢測

取凍存胰腺組織,用Trizol(Invitrogen公司)提取組織總mRNA，紫外分光光度計檢測mRNA的純度和含量。Ptch引物上游5′-TGGTCACACGAACAATGG-3′ ，下游5′-TGAACTGGGCAGCTATGA-AGTC-3′，擴增片段202 bp；Smo引物上游5′-AGTTACATCGCAGCCTTC-3′，下游5′-CACACTACTCCA-GCCATC-3′，擴增片段299 bp；Gli1引物上游5′-TGCTGACACTCTGGGATA-3′，下游5′-CAGGGCCATAGTTGGTT-3′，擴增長度132 bp；內(nèi)參GAPDH引物上游5′-ATCACTGCCACTCAGAAGAC-3′，下游5′-GCATCAAAGGTGGAAGAAT-3′， 擴增片段211 bp。引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由上海英駿生物技術(shù)公司合成。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)合成cDNA,實時熒光定量PCR法檢測mRNA表達(dá)。采用三步法對Ptch、Smo、G1i 1、GAPDH同時行實時PCR擴增。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 20 s、60℃ 34 s、72℃ 25 s，40個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束后,從55℃至95℃每隔10 s升0.5℃,并收集一次熒光信號獲得熔解曲線。通過PCR儀自帶軟件獲取△Ct值，目的基因mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct 值=△Ct值目的基因-△Ct值內(nèi)參基因。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠CP模型的建立

對照組大鼠一般情況良好，未見胰腺大體和組織學(xué)改變。CP組大鼠體重下降，精神狀況較差，毛發(fā)無光澤、易激惹，活動減少，行動緩慢，個別體重明顯減輕。實驗過程中，CP組死亡4只，制模成功率73.9%(34/46)。CP大鼠的胰腺充血、水腫，主胰管輕度至重度擴張，胰腺組織呈黃色、薄平，部分大鼠可見膽管重度擴張、肝臟腫大、膽汁淤積等改變；鏡下見不同程度的腺泡壞死、萎縮，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，小葉內(nèi)或小葉周圍纖維化形成，伴胰管擴張(圖1上)。

二、胰腺組織膠原含量

對照組僅見血管壁膠原沉積，膠原含量為(7.37±2.28)%。CP組胰腺組織內(nèi)膠原沉積在導(dǎo)管周圍至小葉內(nèi)和小葉周圍(圖1下)，膠原含量為(38.52±6.49)%，顯著高于對照組(P=0.026) 。

三、胰腺組織Ptch、 Smo 、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)

Ptch、Smo蛋白主要定位于胞質(zhì)及胞膜，Gli1蛋白主要定位于胞質(zhì)和胞核。10只正常大鼠胰腺組織中均未見Ptch、 Smo 、Gli1蛋白表達(dá)(圖2)。34只CP大鼠的胰腺組織中，25只(73.5%)有Ptch蛋白表達(dá)；22只(64.7%)有Smo蛋白表達(dá)；18只(52.9%)有Gli1蛋白表達(dá)(圖2)。

圖1對照組(a)和CP組(b)胰腺組織病理改變(上，HE ×200)及膠原纖維沉著(下，Sirius red染色 ×200)

圖2對照組(左)和CP組(右)胰腺組織Ptch(a)、Smo(b)、Gli1(c)蛋白的表達(dá)(免疫組化 ×200)

對照組大鼠胰腺組織Ptch、Smo、Gli1 mRNA均呈低表達(dá)，相對表達(dá)量分別為0.23±0.16、0.14±0.05、0.57±0.12；CP大鼠胰腺Ptch、Smo、Gli1mRNA均呈高表達(dá)，表達(dá)量分別為2.38±0.42、3.85±1.03、4.63±1.49，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018、0.037、0.024) 。

討 論

DBTC對胰腺腺泡細(xì)胞具有直接毒性，它最初引起急性胰腺炎，隨著炎癥持續(xù)存在，壞死的腺泡細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，激活胰腺星狀細(xì)胞，合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，形成纖維化病變[7]。 該模型在病因、致病機制及病理等方面與臨床上的CP有相似之處，且有較好的重復(fù)性和操作性。本實驗采用DBTC注射獲得較高的制模成功率，胰腺組織的病理學(xué)改變亦證實造模成功。

文獻(xiàn)報道[8]，基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌及胰腺癌等組織中均可觀察到hedgehog信號通路的異常表達(dá)，表明hedgehog通路參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，CP大鼠的胰腺組織中存在hedgehog信號通路的過度激活，表明該通路亦參與胰腺慢性炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程，但具體機制有待于進(jìn)一步探討。

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Expressionofhedgehogsignalpathwayinratswithchronicpancreatitis

XIAWei,WANGLuo-wei,GAOJun,HUANGLing,LIZhao-shen.
DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433，China

LIZhao-shen,Email：lizhaoshench@gmail.com

ObjectiveTo explore the expression and significance of hedgehog signal molecules (Ptch, Smo and Gli1) in chronic pancreatitis tissues in rats.MethodsSixty SD rats were randomly divided into CP group (n=50) and control group (n=10). DBTC solvent (8 mg·ml-1·kg-1) was injected into the rat via tail vein in CP group. In control group, rats were treated only with the solvent at a dose of 1ml/kg body weight. All rats were sacrificed 6 weeks later to observe the pancreatic pathologic changes. Collagen accumulation in pancreatic sections was determined by staining for Sirius red. Expressions of Ptch, Smo, Gli1 mRNA and protein in pancreatic tissues were assessed by RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsThe rate of chronic pancreatitis development in rats in CP group within six weeks was 73.9%. Collagen content was markedly higher in CP group than that in control group [(38.52±6.49)%vs(7.37±2.28)%,P<0.05]. No Path, Smo, Gli1 protein expression was observed in normal pancreatic tissues in control group. The positive rate of Ptch, Smo, Gli 1 expression was 73.5%, 64.7% and 52.9% in CP group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The expressions of Ptch, Smo, Gli1 mRNA were 2.38±0.42, 3.85±1.03, 4.63±1.49 in CP group, which were significantly higher than those in control group (0.23±0.16, 0.14±0.05, 0.57±0.12,P<0.05).ConclusionsThe Ptch, Smo, Gli1 was highly expressed in pancreatic tissues in CP rats, suggests hedgehog messenger pathway may play an important role in the chronic inflammation and fibrosis of chronic pancreatitis.

Chronic pancreatitis； Hedgehog signal pathways； Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.011

國家自然科學(xué)基金(30700360)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：lizhaoshench@gmail.com

2011-05-24)

(本文編輯：屠振興)