劉曉蕾，梁嘉妮，梁珊妮，劉永建，姚海英，蔡 怡

（1.保定市第一中心醫(yī)院 血 液內(nèi)科，河北 保 定071000；2.保定市第二醫(yī)院，河北 保 定071000；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保 定071000）

甲磺酸伊馬替尼是臨床上治療慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）的一線抗癌藥，通過競爭性抑制酪氨酸激酶而有效地治療CML。而免疫細(xì)胞激活和分化需要ABL酪氨酸激酶的激活，伊馬替尼可能通過阻斷該信號途徑抑制免疫功能。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病患者T淋巴細(xì)胞增殖和活性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

30例慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血細(xì)胞的PMI－1640培養(yǎng)液購自上海麗臣生物科技有限公司，10%胎牛血清購自Sigma公司，尼龍毛柱購自日本W(wǎng)AKO，植物血凝素（PHA）購自上海生工，二甲基亞砜（DMSO）購自 millipore，伊馬替尼（Imatinib）購自Selleck公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自sigma公司，抗人CD 3單克隆抗體、FITC標(biāo)記的CD 69、CD 25和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的HLA－DR單克隆抗體購自Epigenbiotech。

1.2 方法

1.2.1 T細(xì)胞采集與處理 從2006－2011年在我院治療的在治和隨訪的慢性粒細(xì)胞白血病患者中選出年齡45～50歲病情相似的慢性粒細(xì)胞白血病患者30例，取外周血細(xì)胞50 ml，用尼龍毛柱法分離T淋巴細(xì)胞。PBS洗滌后，用RPMI－1640完全培養(yǎng)液在96孔板上培養(yǎng)，并調(diào)整濃度為3X 106／ml，隨機(jī)分為對照組和處理組。兩組樣本同時加入PHA（5 μg／ml）、抗CD 3單克隆抗體（60 ng／ml）。處理組加入用DMSO溶解的濃度為5μmol／L的伊馬替尼，對照組中加入等量的DMSO。在37C、5%CO2和濕潤的條件下培養(yǎng)。每隔1天換液半量，并補(bǔ)充等濃度的PHA、抗CD3單克隆抗體和伊馬替尼。

1.2.2 MTT法檢測T細(xì)胞增殖和活性 MTT法能夠通過OD值反映細(xì)胞的存活和生長，OD值與細(xì)胞數(shù)量成正比。在加入伊馬替尼之前和加入之后24 h、48 h和72 h后分別加 MTT（5 mg／ml）檢測T細(xì)胞增殖和活性。用酶標(biāo)儀在450 nm處測各孔OD值。所有標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品均作復(fù)孔。

1.2.3 ELISA法檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN－γ 72 h后，取上述上清液，采用ELISA方法檢測IFN－γ的濃度。所有標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品均作復(fù)孔。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞表面活性標(biāo)記 用流式細(xì)胞儀標(biāo)記液PBA（PBS＋10%BSA＋0.02%疊氮鈉）懸浮T細(xì)胞，分別加入CD 25、CD 69和HLADR單克隆抗體標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面活性標(biāo)記。

1.3 統(tǒng)計處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x－±s）表示 ，用SPSS l3.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞增殖和活性

與對照組相比，Imatinib加入前處理組OD值沒有顯著性差異（P＞0.05），Imatinib加入24 h、48 h和72 h后差異有顯著性（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響（OD值）（x－±s）

2.2 T細(xì)胞分泌的IFN－γ

72 h后，經(jīng)過ELISA測得對照組和處理組IFN－γ的濃度分別為（6.39±0.96）和（2.83±0.46）ng／m，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 T細(xì)胞表面活性標(biāo)記

通過流式細(xì)胞儀檢測，處理組和對照組的CD25、CD69和HLA－DR表面免疫活性標(biāo)記均有顯著性差異（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞表面免疫活性標(biāo)記表達(dá)的影響（%）（x－±s）

圖2 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞表面免疫活性標(biāo)記表達(dá)的影響

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）是骨髓增殖性疾病之一，其致病基因因素是9號和22號染色體的轉(zhuǎn)位t（9；22）（q34；q11），因而導(dǎo)致BCR—ABL融合酪氨酸激酶失去抑制，過度表達(dá)激酶。［1］伊馬替尼是人工合成的的強(qiáng)有力的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），通過選擇性結(jié)合bcr／abl蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭性抑制abl的酪氨酸激酶使活性降低，從而阻斷下游多條信號傳導(dǎo)通路，慢性粒細(xì)胞白血病得到有效的治療。［2］業(yè)已證實(shí)，伊馬替尼不僅對CML有效，對其他由于酪氨酸激酶持續(xù)激活而引起的惡性腫瘤也有效：Ph＋ 急性淋巴細(xì)胞白血病、血小板源性生長因子受體（PDGFR）突變引起的骨髓增殖性疾病、干細(xì)胞生長因子受體c－KIT突變引起的胃腸間質(zhì)腫（GIST）［3－5］。伊馬替尼是屬于靶向分子的治療方法，是治療CML的一線抗癌藥物，它相比一般的化療藥物對癌細(xì)胞更有選擇性。［6］然而臨床上通過伊馬替尼治療CML患者過程中以及隨訪中，已發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤和感染發(fā)生率增高的情況。例如，Mattiuzzi GN等［7］發(fā)現(xiàn)給予伊馬替尼治療CML的病人發(fā)生帶狀皰疹的幾率增加，用抗病毒的藥物癥狀消失。Bekkenk MW等［8］報道一位病人用了伊馬替尼后發(fā)生EB病毒感染的B細(xì)胞淋巴瘤。Miyachi K等［9］發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕關(guān)節(jié)病病人并發(fā)2個月的CML之后用伊馬替尼治療后關(guān)節(jié)炎得到緩解。Tybulewicz VL［10］等使用了 ABL－／－敲基因的小鼠，其作用機(jī)制與伊馬替尼相同，發(fā)現(xiàn)小鼠胸腺和脾臟萎縮，出現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞造成的淋巴細(xì)胞減少癥。這些報道或直接或間接說明伊馬替尼有抑制免疫功能的副作用。因此深入研究其副作用并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥越來越必要。

本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)、MTT法檢測T細(xì)胞增殖和活性、ELISA法檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞表面活性標(biāo)記等方法和過程來探討伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病患者T細(xì)胞影響。

T細(xì)胞增殖和活性實(shí)驗(yàn)中，無論伊馬替尼加入前處理組OD值與對照組沒有顯著性差異，說明伊馬替尼加入前處理組和對照組的條件是一致的。而伊馬替尼加入后的24h、48h、72h處理組與對照組有顯著性差異，說明伊馬替尼能夠抑制T細(xì)胞的增殖。Allan B.Dietz［11］等通過體外培養(yǎng)健康捐獻(xiàn)者的T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)使用CML患者相似治療濃度的伊馬替尼能抑制T細(xì)胞的增殖，用植物血凝素非特異性刺激之后表現(xiàn)更明顯，而且伊馬替尼并不殺死T細(xì)胞和誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。Cwynarski［12］等發(fā)現(xiàn)人T細(xì)胞和伊馬替尼在體外進(jìn)行共培養(yǎng)時，T細(xì)胞的增殖能力隨著伊馬替尼濃度的增大而逐漸下降，即使用抗CD3單抗和植物血凝素刺激實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞，其增殖能力也并沒有反轉(zhuǎn)。并且兩種刺激所產(chǎn)生的抑制程度之間沒有差異。利用流式細(xì)胞技術(shù)中的標(biāo)記物annexin—V來檢測細(xì)胞凋亡情況，沒有T細(xì)胞的凋亡增加的現(xiàn)象。提示伊馬替尼的抑制作用和T細(xì)胞凋亡無關(guān)。以上兩者結(jié)果與本研究基本一致。通過ELISA法檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN－γ，處理組和對照組IFN－γ分泌量有顯著性差異，說明伊馬替尼能抑制T細(xì)胞活化為效應(yīng)T細(xì)胞，因而抑制了T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。T細(xì)胞表面活性標(biāo)記的檢測中，處理組和對照組的CD25、CD69、HLADR表面免疫活性標(biāo)記均有顯著性差異。，進(jìn)一步說明伊馬替尼抑制T細(xì)胞激活為效應(yīng)T細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明伊馬替尼能夠抑制T細(xì)胞的增殖和活化，使得效應(yīng)T細(xì)胞減少，免疫功能受到抑制，因而發(fā)生感染和癌癥的幾率增大。K Cwynarski［13］的研究結(jié)果與本研究基本一致，伊馬替尼在體外實(shí)驗(yàn)中抑制了T細(xì)胞的增殖和活化。這對臨床上用藥具有指導(dǎo)意義，在伊馬替尼治療CML的同時還應(yīng)該輔以增強(qiáng)免疫的藥物。

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