劉曉蕾,梁嘉妮,梁珊妮,劉永建,姚海英,蔡 怡
(1.保定市第一中心醫(yī)院 血 液內(nèi)科,河北 保 定071000;2.保定市第二醫(yī)院,河北 保 定071000;3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 保 定071000)
甲磺酸伊馬替尼是臨床上治療慢性粒細(xì)胞白血?。–ML)的一線抗癌藥,通過競爭性抑制酪氨酸激酶而有效地治療CML。而免疫細(xì)胞激活和分化需要ABL酪氨酸激酶的激活,伊馬替尼可能通過阻斷該信號途徑抑制免疫功能。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病患者T淋巴細(xì)胞增殖和活性的影響,現(xiàn)報告如下。
30例慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血細(xì)胞的PMI-1640培養(yǎng)液購自上海麗臣生物科技有限公司,10%胎牛血清購自Sigma公司,尼龍毛柱購自日本W(wǎng)AKO,植物血凝素(PHA)購自上海生工,二甲基亞砜(DMSO)購自 millipore,伊馬替尼(Imatinib)購自Selleck公司,四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自sigma公司,抗人CD 3單克隆抗體、FITC標(biāo)記的CD 69、CD 25和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的HLA-DR單克隆抗體購自Epigenbiotech。
1.2.1 T細(xì)胞采集與處理 從2006-2011年在我院治療的在治和隨訪的慢性粒細(xì)胞白血病患者中選出年齡45~50歲病情相似的慢性粒細(xì)胞白血病患者30例,取外周血細(xì)胞50 ml,用尼龍毛柱法分離T淋巴細(xì)胞。PBS洗滌后,用RPMI-1640完全培養(yǎng)液在96孔板上培養(yǎng),并調(diào)整濃度為3X 106/ml,隨機(jī)分為對照組和處理組。兩組樣本同時加入PHA(5 μg/ml)、抗CD 3單克隆抗體(60 ng/ml)。處理組加入用DMSO溶解的濃度為5μmol/L的伊馬替尼,對照組中加入等量的DMSO。在37C、5%CO2和濕潤的條件下培養(yǎng)。每隔1天換液半量,并補(bǔ)充等濃度的PHA、抗CD3單克隆抗體和伊馬替尼。
1.2.2 MTT法檢測T細(xì)胞增殖和活性 MTT法能夠通過OD值反映細(xì)胞的存活和生長,OD值與細(xì)胞數(shù)量成正比。在加入伊馬替尼之前和加入之后24 h、48 h和72 h后分別加 MTT(5 mg/ml)檢測T細(xì)胞增殖和活性。用酶標(biāo)儀在450 nm處測各孔OD值。所有標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品均作復(fù)孔。
1.2.3 ELISA法檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ 72 h后,取上述上清液,采用ELISA方法檢測IFN-γ的濃度。所有標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品均作復(fù)孔。
1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞表面活性標(biāo)記 用流式細(xì)胞儀標(biāo)記液PBA(PBS+10%BSA+0.02%疊氮鈉)懸浮T細(xì)胞,分別加入CD 25、CD 69和HLADR單克隆抗體標(biāo)記,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面活性標(biāo)記。
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x-±s)表示 ,用SPSS l3.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
與對照組相比,Imatinib加入前處理組OD值沒有顯著性差異(P>0.05),Imatinib加入24 h、48 h和72 h后差異有顯著性(P<0.05)。見表1和圖1。
表1 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響(OD值)(x-±s)
72 h后,經(jīng)過ELISA測得對照組和處理組IFN-γ的濃度分別為(6.39±0.96)和(2.83±0.46)ng/m,兩者有顯著性差異(P<0.05)。
圖1 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響
通過流式細(xì)胞儀檢測,處理組和對照組的CD25、CD69和HLA-DR表面免疫活性標(biāo)記均有顯著性差異(P<0.05)。見表2和圖2。
表2 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞表面免疫活性標(biāo)記表達(dá)的影響(%)(x-±s)
圖2 伊馬替尼對T淋巴細(xì)胞表面免疫活性標(biāo)記表達(dá)的影響
慢性粒細(xì)胞白血?。–ML)是骨髓增殖性疾病之一,其致病基因因素是9號和22號染色體的轉(zhuǎn)位t(9;22)(q34;q11),因而導(dǎo)致BCR—ABL融合酪氨酸激酶失去抑制,過度表達(dá)激酶。[1]伊馬替尼是人工合成的的強(qiáng)有力的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI),通過選擇性結(jié)合bcr/abl蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭性抑制abl的酪氨酸激酶使活性降低,從而阻斷下游多條信號傳導(dǎo)通路,慢性粒細(xì)胞白血病得到有效的治療。[2]業(yè)已證實(shí),伊馬替尼不僅對CML有效,對其他由于酪氨酸激酶持續(xù)激活而引起的惡性腫瘤也有效:Ph+ 急性淋巴細(xì)胞白血病、血小板源性生長因子受體(PDGFR)突變引起的骨髓增殖性疾病、干細(xì)胞生長因子受體c-KIT突變引起的胃腸間質(zhì)腫(GIST)[3-5]。伊馬替尼是屬于靶向分子的治療方法,是治療CML的一線抗癌藥物,它相比一般的化療藥物對癌細(xì)胞更有選擇性。[6]然而臨床上通過伊馬替尼治療CML患者過程中以及隨訪中,已發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤和感染發(fā)生率增高的情況。例如,Mattiuzzi GN等[7]發(fā)現(xiàn)給予伊馬替尼治療CML的病人發(fā)生帶狀皰疹的幾率增加,用抗病毒的藥物癥狀消失。Bekkenk MW等[8]報道一位病人用了伊馬替尼后發(fā)生EB病毒感染的B細(xì)胞淋巴瘤。Miyachi K等[9]發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕關(guān)節(jié)病病人并發(fā)2個月的CML之后用伊馬替尼治療后關(guān)節(jié)炎得到緩解。Tybulewicz VL[10]等使用了 ABL-/-敲基因的小鼠,其作用機(jī)制與伊馬替尼相同,發(fā)現(xiàn)小鼠胸腺和脾臟萎縮,出現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞造成的淋巴細(xì)胞減少癥。這些報道或直接或間接說明伊馬替尼有抑制免疫功能的副作用。因此深入研究其副作用并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥越來越必要。
本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)、MTT法檢測T細(xì)胞增殖和活性、ELISA法檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞表面活性標(biāo)記等方法和過程來探討伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病患者T細(xì)胞影響。
T細(xì)胞增殖和活性實(shí)驗(yàn)中,無論伊馬替尼加入前處理組OD值與對照組沒有顯著性差異,說明伊馬替尼加入前處理組和對照組的條件是一致的。而伊馬替尼加入后的24h、48h、72h處理組與對照組有顯著性差異,說明伊馬替尼能夠抑制T細(xì)胞的增殖。Allan B.Dietz[11]等通過體外培養(yǎng)健康捐獻(xiàn)者的T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)使用CML患者相似治療濃度的伊馬替尼能抑制T細(xì)胞的增殖,用植物血凝素非特異性刺激之后表現(xiàn)更明顯,而且伊馬替尼并不殺死T細(xì)胞和誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。Cwynarski[12]等發(fā)現(xiàn)人T細(xì)胞和伊馬替尼在體外進(jìn)行共培養(yǎng)時,T細(xì)胞的增殖能力隨著伊馬替尼濃度的增大而逐漸下降,即使用抗CD3單抗和植物血凝素刺激實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞,其增殖能力也并沒有反轉(zhuǎn)。并且兩種刺激所產(chǎn)生的抑制程度之間沒有差異。利用流式細(xì)胞技術(shù)中的標(biāo)記物annexin—V來檢測細(xì)胞凋亡情況,沒有T細(xì)胞的凋亡增加的現(xiàn)象。提示伊馬替尼的抑制作用和T細(xì)胞凋亡無關(guān)。以上兩者結(jié)果與本研究基本一致。通過ELISA法檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ,處理組和對照組IFN-γ分泌量有顯著性差異,說明伊馬替尼能抑制T細(xì)胞活化為效應(yīng)T細(xì)胞,因而抑制了T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。T細(xì)胞表面活性標(biāo)記的檢測中,處理組和對照組的CD25、CD69、HLADR表面免疫活性標(biāo)記均有顯著性差異。,進(jìn)一步說明伊馬替尼抑制T細(xì)胞激活為效應(yīng)T細(xì)胞。
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明伊馬替尼能夠抑制T細(xì)胞的增殖和活化,使得效應(yīng)T細(xì)胞減少,免疫功能受到抑制,因而發(fā)生感染和癌癥的幾率增大。K Cwynarski[13]的研究結(jié)果與本研究基本一致,伊馬替尼在體外實(shí)驗(yàn)中抑制了T細(xì)胞的增殖和活化。這對臨床上用藥具有指導(dǎo)意義,在伊馬替尼治療CML的同時還應(yīng)該輔以增強(qiáng)免疫的藥物。
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