張媛媛，韋慶益，袁爾東，寧正祥

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

蘿卜紅色素的酯化修飾及性質(zhì)研究

張媛媛，韋慶益，袁爾東，寧正祥*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

蘿卜紅色素是安全、無毒副作用的天然食用色素，具有抗氧化能力。但是它的穩(wěn)定性不高，限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。通過乙酰水楊酸酯化修飾色素，測定色素的穩(wěn)定性，并采用ABTS(2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽)法和鄰二氮菲法測定色素的抗氧化活性。結(jié)果顯示，修飾后的蘿卜紅色素穩(wěn)定性明顯提高，而且仍然保持較高的抗氧化活性。

蘿卜紅色素，乙酰水楊酸，穩(wěn)定性，抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘿卜紅色素E40 云南通海楊氏天然產(chǎn)物有限公司，50℃干燥2h;ABTS 上海阿拉丁;乙酰水楊酸廣州化學(xué)試劑廠，60℃干燥4h;吡啶、二氯甲烷廣州化學(xué)試劑廠，按文獻(xiàn)［12］中的方法干燥;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、磷酸、氫氧化鈉、氯化亞砜、氯化鈣、氯化鐵、鄰二氮菲、雙氧水、硫酸亞鐵 分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

725S型分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司; RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠; SevenEasy實驗pH計 梅特勒－托利多儀器上海有限公司;Brucker Tensor 27紅外光譜儀 波數(shù)范圍為4000～500cm－1，美國Nicolet公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙酰水楊酸酰氯的制備 由于蘿卜紅色素和乙酰水楊酸酯化的空間位阻很大，而乙酰水楊酸的酰氯形式很活潑，所以先制備酰氯再酯化［13］。圓底燒瓶中加0.18g乙酰水楊酸和2mL氯化亞砜，連接回流冷凝管，冷凝管接裝有CaCl2的干燥管，用10% NaOH溶液吸收尾氣。加熱至70℃，磁力攪拌至無氣體產(chǎn)生。0.08～0.09MPa下70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸出多余氯化亞砜，酰氯產(chǎn)物加5mL二氯甲烷保護(hù)。

1.2.2 乙酰水楊酸對蘿卜紅色素的酯化修飾 0.5g色素和5mL吡啶加入三口瓶，連接溫度計、回流冷凝管和滴液漏斗，滴液漏斗中加入酰氯乙酰水楊酸。控制在50℃時逐滴加入酰氯乙酰水楊酸，反應(yīng)5h。反應(yīng)后油泵50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶和二氯甲烷，加水溶解，離心除去不溶物，得水溶性色素。0.08～0.09MPa下50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到紅色粉末。

1.2.3 紅外光譜結(jié)構(gòu)表征 分別取蘿卜紅色素和酯化修飾的蘿卜紅色素粉末，與KBr混合研磨，均勻后壓片，用紅外光譜儀在4000～400cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行測定。

1.2.4 穩(wěn)定性的測定

1.2.4.1 pH對色素穩(wěn)定性的影響 用0.10mol/L的檸檬酸溶液、0.10mol/L的磷酸氫二鈉溶液和0.10mol/L的磷酸二氫鈉溶液，配制pH 3、4、5、6、7、8的磷酸鹽緩沖溶液。分別用緩沖液配制不同pH的色素溶液，放置15min后觀察顏色變化并測定最大吸收波長。

1.2.4.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 用pH 3的磷酸鹽緩沖溶液配制合適吸光值色素溶液，分別在室溫、50、60、70、80、100℃加熱1h后，分別在512nm下測定吸光值。

1.2.4.3 光對色素穩(wěn)定性的影響 用pH 3的磷酸鹽緩沖液配制合適吸光值的色素溶液，每天放在室內(nèi)散射光(180Lux)和室外自然光(54500Lux)下照射8h，在512nm下測定吸光值。

1.2.5 抗氧化性的測定

1.2.5.1 ABTS法測定色素總抗氧化能力 用8mmol/LABTS與3mmol/L過硫酸鉀，在去離子水中室溫反應(yīng)16h。然后用pH 7.40的磷酸鹽緩沖液稀釋至734nm處的吸光值為0.70±0.02，得到ABTS+自由基溶液，該溶液要現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品與ABTS+自由基溶液混合，黑暗反應(yīng)30min，734nm測吸光值，記為樣品A。同時做樣品參比(用PBS代替ABTS+)和對照(用PBS代替樣品)，分別記為樣參A和對照A［14］。以VC作為陽性對照。清除率用以下公式計算:

1.2.5.2 色素對羥自由基清除能力的測定 取0.40mL PBS、蒸餾水0.80mL于1.50mL離心管中，作為空白參比管;取0.40mL PBS、0.20mL鄰二氮菲(1.50mmol/L)、0.20mLFeSO4(1.50mmol/L)和0.40mL蒸餾水，作為未損傷管;取 0.40mL PBS、0.20mL鄰二氮菲(1.50mmol/L)、0.20mLFeSO4(1.50mmol/L)、0.20mL蒸餾水和 0.20mLH2O2(0.02%)，作為損傷管;取0.40mL PBS、0.20mL待測樣和0.20mL蒸餾水，作為樣品參比管;取0.40mL PBS、0.20mL鄰二氮菲(1.50mmol/L)、0.20mL FeSO4(1.50mmol/L)、0.20mL待測樣和0.20mL H2O2，作為樣品管［15］。

將上述管置恒溫水浴鍋中，37℃保溫1h后，在536nm處測定吸光值。以VC作為陽性對照。清除率按下式計算:

2 結(jié)果與討論

2.1 酯化修飾結(jié)果

酯化修飾后的蘿卜紅色素具有很好的穩(wěn)定性，其色價為30.2，損失率為9.8%。蘿卜紅色素苯并吡喃環(huán)上的C－7、C－4’位和糖環(huán)C上的羥基，都可能是酯化的位置。

2.2 紅外光譜結(jié)構(gòu)表征

圖1的圖譜a為修飾前蘿卜紅色素的紅外光譜圖，a、b圖中，3400cm－1附近有一個寬而強(qiáng)的吸收峰，為芳環(huán)與糖基上羥基的伸縮振動吸收峰。2925.80cm－1的吸收峰是由糖環(huán)中亞甲基的C－H鍵伸縮振動引起的。1701.09cm－1為羰基的伸縮振動，1604.66cm－1為C－O的對稱與不對稱伸縮振動，說明蘿卜紅色素具有酰基化結(jié)構(gòu)。1514.01、1448.44cm－1為芳環(huán)和雜環(huán)骨架振動。1342.36、1269.07、1174.56和1074.27cm－1為糖環(huán)中 C－O－C的伸縮振動吸收峰。

圖1中的圖譜b為乙酰水楊酸酯化修飾后蘿卜紅色素的紅外光譜圖，圖中除了具有蘿卜紅色素原有吸收峰外，還有1720.38cm－1處的酯C=O的特征吸收;1604.66cm－1處C－O的伸縮振動明顯增強(qiáng); 1249.78cm－1的強(qiáng)峰為乙酸酯C－O－C的伸縮振動吸收峰，初步判定可能生成了酯鍵。在757.97cm－1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰，為苯環(huán)的鄰位取代，是乙酰水楊酸區(qū)別于蘿卜紅色素的結(jié)構(gòu)特征。

圖1 修飾前后蘿卜紅色素的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of red radish pigment and esterfied pigment

2.3 色素穩(wěn)定性

2.3.1 pH對色素穩(wěn)定性的影響 蘿卜紅色素的顏色隨著pH的變化而變化。如表1所示，修飾前的色素顏色及最大吸收波長在不同pH下有很大差異。顏色及最大吸收波長變化的原因是花色苷在不同的pH下以不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在的。強(qiáng)酸性介質(zhì)(pH 1)中，紅色的2－苯并吡喃鹽占主導(dǎo)地位;pH增加，2－苯并吡喃鹽被水親和攻擊變?yōu)闊o色的甲醇假堿，甲醇假堿失去A環(huán)和B環(huán)之間的共軛雙鍵，不能吸收可見光。同時隨著pH增加中性的紫色醌式堿增加。當(dāng)pH繼續(xù)增加，生成的無色甲醇假堿通過開環(huán)生成查耳酮形式，同時中性的醌式堿轉(zhuǎn)化為離子化的藍(lán)色醌式堿酯化修飾后的色素在pH 3～5都為鮮紅色，最大吸收波長保持在514nm左右。雖然pH大于5后顏色仍然變化很大，但相對于修飾前的色素，其對pH的穩(wěn)定性有了很大提高，在很大程度上提高了色素的應(yīng)用范圍。

表1 修飾前后蘿卜紅色素在不同pH下的最大吸收波長(λmax)及顏色變化Table 1 Maximum absorption wavelength(λmax)and color of red radish pigment and esterfied pigment

2.3.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 由圖2可以看出，修飾前色素在50℃以下較穩(wěn)定，而50℃以上吸光值下降很快。加熱前，蘿卜紅色素的吸光值為1.154，100℃加熱1h后為0.953，損失率達(dá)17.42%。

修飾后色素對溫度很穩(wěn)定。加熱前吸光值為0.651，100℃加熱1h后為0.593，損失率僅為8.91%。所以乙酰水楊酸修飾色素可以很好地提高蘿卜紅色素對溫度的穩(wěn)定性。

圖2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on stability of pigment

2.3.3 光對色素穩(wěn)定性的影響 從圖3可知，在室內(nèi)散射光下照射時，酯化修飾前后的蘿卜紅色素都較穩(wěn)定，色調(diào)沒有變化。放置5d后修飾前的色素?fù)p失率為13.73%，修飾后的色素幾乎沒有損失。

在室外自然光照射下，色素的穩(wěn)定性差異很大。照射時間在3d內(nèi)，修飾前后蘿卜紅色素的損失率都不大。但是隨著時間繼續(xù)增加，修飾前的色素開始出現(xiàn)較大損失，照射5d后，修飾前的色素?fù)p失率達(dá)48.59%。其原因可能是光照條件下酰基脫落，導(dǎo)致蘿卜紅色素穩(wěn)定性下降。修飾后的色素也有損失，照射5d后，損失率為21.69%。所以乙酰水楊酸酯化修飾蘿卜紅色素可以明顯提高其對光的穩(wěn)定性。

2.4 抗氧化性結(jié)果

2.4.1 ABTS法結(jié)果 色素對ABTS+自由基的清除能力可以用來衡量色素總的抗氧化能力。從蘿卜紅色素對ABTS+自由基的清除能力可以看出，蘿卜紅色素比VC清除自由基的能力強(qiáng)，且清除率隨濃度的增加而增大。色素濃度在0.01mg/mL時清除率就達(dá)到了98.49%，而VC濃度為0.01mg/mL時清除率為79.50%。乙酰水楊酸修飾后色素清除自由基的能力略有降低，但仍比VC的清除效果好。色素濃度為0.01mg/mL時清除率為84.42%。清除率也隨濃度的增大而增大，當(dāng)濃度增大到一定值時，清除率增加緩慢，這可能是由于羥基被新的取代基取代而降低了色素的抗氧化能力。

圖3 光對色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light on stability of pigment

圖4 色素清除ABTS+自由基的能力Fig.4 Scavenging ability of pigment on ABTS+radical

2.4.2 羥自由基的清除能力 鄰二氮菲法是檢測抗氧化劑清除羥自由基能力的一種簡單便捷的方法。由于Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基能夠氧化反應(yīng)體系中的Fe2+，從而能夠評價抗氧化劑清除羥自由基的能力。濃度低時，蘿卜紅色素比VC清除羥自由基的能力弱，而清除能力隨濃度的增加而增大，濃度達(dá)到0.18mg/mL時，色素對羥自由基的清除率達(dá)到98.04%。乙酰水楊酸修飾后，由于乙酰水楊酸的羧基與色素苯環(huán)上的羥基發(fā)生了酯化，使苯環(huán)上羥基數(shù)量減少，明顯降低了色素清除羥自由基的能力。但是色素對羥自由基的清除率仍隨濃度增加而迅速增大，所以修飾后的色素保持了對羥自由基良好的清除能力。

圖5 色素清除羥自由基的能力Fig.5 Scavenging ability of pigment on hydroxyl radical

3 結(jié)論

本研究通過對蘿卜紅色素進(jìn)行乙酰水楊酸酯化修飾，得到的色素對pH、溫度和光的穩(wěn)定性明顯提高。修飾前色素只在pH 3為鮮紅色，修飾后色素在pH3～5范圍內(nèi)都能維持鮮紅色。修飾前色素只是在50℃以下較穩(wěn)定，50℃以上加熱后吸光值則下降很快。而修飾后的色素在100℃都可表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。修飾后色素在室外自然光照射5d后，損失率僅為21.69%，其耐光性明顯優(yōu)于修飾前。修飾后色素穩(wěn)定性的提高，可能是由于乙酰水楊酸和蘿卜紅色素形成的酯鍵?？寡趸钚詫嶒灡砻?，修飾后的色素仍然保持了色素原有的抗氧化活性。因而修飾后的色素有著更廣泛的應(yīng)用前景和利用價值，為蘿卜紅色素在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供了可行性。

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Research of esterified modification and characterization of red radish pigment

ZHANG Yuan－yuan，WEI Qing－yi，YUAN Er－dong，NING Zheng－xiang*
(College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The red radish pigment is a natural edible pigment with the characteristics of safety，free of side effect and antioxidant activity.However，the instability of this pigment limits its use in food industry.In this paper，the red radish pigment was modified by acetyl salicylic and the stability of the modified pigment was compared with natural pigment.Antioxidant activity was determined by ABTS(2，2'－Azinobis－(3－ethylbenzthiazoline－6－sulphonate))and phenanthroline methods.The result indicated that stability of modified pigment was improved significantly，while antioxidant activity kept high levels.

red radish pigment;acetyl salicylic;stability;antioxidant activity

TS202.3

A

1002－0306(2012)10－0313－04

胭脂蘿卜又稱紅心蘿卜，皮肉深紫，肉質(zhì)酥脆。重慶的涪陵、武隆、南川等縣是胭脂蘿卜的主要產(chǎn)區(qū)［1］。它的蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、鐵、維生素B1、維生素B2含量比白蘿卜高，有消食、順氣、化痰、止咳、利尿、補(bǔ)虛等作用。從胭脂蘿卜中提取的蘿卜紅色素安全、無毒，具有抗氧化等多種生物活性［2］，可廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品等領(lǐng)域。蘿卜紅色素屬于花色苷類天然色素［3］，是天竺葵素的葡萄糖苷衍生物，為天竺葵素－3－槐二糖－5－葡萄糖的雙?；Y(jié)構(gòu)，并可結(jié)合(?；?有阿魏酸(Fer)、對羥基苯丙酸(ρ－cou)、咖啡酸(caf)等有機(jī)酸。由于花色苷性質(zhì)不穩(wěn)定，光、pH、溫度和金屬離子等都會引起其性質(zhì)變化［4－5］。因此提高蘿卜紅色素的穩(wěn)定性，對于它在食品工業(yè)中的應(yīng)用和推廣具有重要的意義。一般可通過添加保護(hù)劑［6］、輔助色素［7］、金屬絡(luò)合［8］、微膠囊化［9］以及?；?0］等方法來提高花色苷類色素的穩(wěn)定性。文中擬采用酯化修飾的方法，使乙酰水楊酸和蘿卜紅色素形成穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，形成空間位阻防止水化作用產(chǎn)生［11］，從而達(dá)到提高色素穩(wěn)定性的目的。并且對蘿卜紅色素清除ABTS(2，2－聯(lián)氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽)自由基和羥自由基的能力進(jìn)行測定，評價其抗氧化能力，為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

2011－09－20 *通訊聯(lián)系人

張媛媛(1986－)，女，研究生，研究方向:食品化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(21002034)。