黃 璇，廖盧艷，范 琳，白 亮，梁一博，蔣立文，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長沙410128; 2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128; 3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128)

固相微萃取法分析納豆揮發(fā)性成分

黃 璇1，廖盧艷1，范 琳2，3，白 亮1，梁一博1，蔣立文2，3，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長沙410128; 2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128; 3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128)

目的:分析納豆中的的主要揮發(fā)性成分。方法:采用固相微萃取法提取、富集納豆中的揮發(fā)性成分，用氣相色譜－質(zhì)譜法(GC－MS)對其化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，用峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量。結(jié)果:共鑒定出55種有機(jī)成分，揮發(fā)性有機(jī)物成分為47種，占總含量的80.49%，主要包括酮類、吡嗪類、醇類、酸類等15類有機(jī)揮發(fā)物。結(jié)論:納豆揮發(fā)性成分主要為川芎嗪(26.223%)、2，5－二甲基吡嗪(23.835%)、2，3－丁二酮(15.648%)、三甲基吡嗪(13.484%)、三甲基惡唑(4.947%)、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪(2.833%)、丙酸2－羥基－1－甲基乙基酯(1.803%)、2，3，5－三甲基－6－川芎嗪(1.758%)、3－羥基－2－丁酮(1.676%)、醋酸乙烯基酯(1.377%)等。

納豆，揮發(fā)性成分，固相微萃取，GC－MS

日本的納豆自須見洋行分離枯草芽孢桿菌(又名納豆菌)以來，其生理保健作用得到深入研究，特別是含有溶栓效果的納豆激酶使其成為世界上知名的藥食同源發(fā)酵大豆制品［1］，每年納豆的市場產(chǎn)值達(dá)到30億美元。目前納豆方面的專利達(dá)到286項，在我國北京、廣州、深圳等地已建立納豆產(chǎn)品生產(chǎn)基地，產(chǎn)品附加值增加超過10倍以上。納豆可以隨口味來選擇不同調(diào)味包食用，但其特有的氨味還不能被中國人普遍接受。隨著現(xiàn)代控制技術(shù)的日益發(fā)展，發(fā)酵產(chǎn)品揮發(fā)性成分分析逐漸成為產(chǎn)品重要的控制指標(biāo)。固相微萃取是最常用的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)樣本采集技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、水、食品、香精香料及煙草等樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的分析，具有成本低、無需有機(jī)溶劑、所需樣品量少、靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡單、方便快捷等特點(diǎn)［2－4］。目前在食品方面，被廣泛的用作風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測。我國有關(guān)納豆激酶、納豆抗菌肽等研究非常深入，如董明盛等人對溶栓納豆菌的篩選［5］，納豆激酶穩(wěn)定性［6］以及納豆及其保健這方面的深入探討［7］等，但是對納豆氣味的改良還不夠深入［8］，目前還沒有從風(fēng)味改良的方向去解決這個問題。本文采用固相微萃取(SPME)與氣相－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對日本納豆中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了較為細(xì)致地分析，再以峰面積歸一化法計算各組分在揮發(fā)性成分中的相對百分含量，為納豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究提供參考，為納豆風(fēng)味改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

旭松牌“納豆一番”納豆 生產(chǎn)日期2010年4月26日，其蛋白質(zhì)含量為13.6%，芽孢桿菌為5× 106cfu/g，氨基酸態(tài)氮含量為0.57%，水分為60.3%。

固相微萃取裝置 包括手柄、導(dǎo)向桿;SPME進(jìn)樣器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;GCMS－QP2010氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;GL－3250磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 固相微萃取法處理過程為:取3g納豆研磨成樣品，加6mL水，攪勻。置于15mL頂空瓶中，于磁力攪拌器上在60℃加熱平衡后，通過隔墊插入已活化好的 SPME萃取頭(270℃活化30min)，推出萃取頭，頂空吸附40min后，插入GC進(jìn)樣口解析5min。

1.2.2 色譜條件 柱型采用(30m×0.25mm× 0.25μm)DB－5ms毛細(xì)管柱，柱溫采用程序升溫，初溫40℃保持3min，然后以5℃/min升至150℃，接著以10℃/min升至250℃，保持10min，再以20℃/min升至270℃，保持1min;進(jìn)樣口溫度250℃，采用不分流，載氣He，流量為1.0mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度200℃，電離方式EI，電子能量70eV，燈絲電流150μA，掃描質(zhì)量范圍33～500m/z。

1.2.4 化合物的鑒定 采用計算機(jī)譜庫(NIST)檢索分析，定量采用峰面積歸一化法求各成分相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆揮發(fā)性成分離子圖譜

圖1為納豆樣品的總離子流分析譜圖。

圖1 納豆揮發(fā)成分的總離子流圖Fig.1 The total ions count chromatogram of volatile components of natto

2.2 納豆揮發(fā)性有機(jī)物成分及相對含量

在分析微量成分時，圖譜上總會出現(xiàn)因方法帶入的某些雜質(zhì)峰。這些物質(zhì)是環(huán)狀的硅氧烷為主，與柱溫升高有關(guān)。因此在計算風(fēng)味有機(jī)化合物成分時故不予考慮［9］，所得55種揮發(fā)性物質(zhì)，只有47種揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，其成分及相對含量見表1。

由表1可得出，各大類化合物含量及種類前6名的物質(zhì)見圖2。

圖2 納豆中排名前6大類揮發(fā)性有機(jī)物總含量Fig.2 The top 6 categories the total content of volatile organic compounds in natto

其中，酮類化合物有10種，含量為17.877%，酯類7種含量為3.335%，吡嗪類6種含量為68.273%，醇類5種含量為2.114%，醛類3種含量為1.109%，烷類3種含量為0.275%，胺類3種含量為0.103%，酸類2種含量為0.826%，苯2種含量為0.331%，醚類1種含量為0.135%，惡唑1種含量為4.947%，咔唑類1種含量為0.106%，哌啶1種含量為0.082%，呋喃1種含量為0.054%，肼1種有0.410%。

由表1可知，揮發(fā)性有機(jī)物中物質(zhì)含量最高的為川芎嗪(26.223%)，其次分別為2，5－二甲基吡嗪(23.835%)、2，3－丁二酮(15.648%)、三甲基吡嗪(13.484%)、三甲基惡唑(4.947%)、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪(2.833%)、丙酸2－羥基－1－甲基乙基酯(1.803%)、2，3，5－三甲基－6－川芎嗪(1.758%)、3－羥基－2－丁酮(1.676%)、醋酸乙烯基酯(1.377%)等。這些物質(zhì)中一些具有特別的生物功能，例如，川芎嗪［10］(2，3，5，6－四甲基吡嗪)是中藥川芎中的主要活性生物堿，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用;咔唑類衍生物［11］具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗微生物、抗組胺、抗氧化和抗炎等。它們氣味特別，其中，2，3－丁二酮［12］又名雙乙酰，在乳制品、奶油、干酪、奶酪以及許多需要奶味的非乳制品中的一種重要風(fēng)味物質(zhì);吡嗪、吡唑和呋喃是美拉德反應(yīng)的特征產(chǎn)物，具有肉品的烘烤風(fēng)味;2，5－二甲基吡嗪具有堅果、馬鈴薯片、巧克力香味;三甲基吡嗪具有濃厚的堅果香氣。值得注意的是，川芎嗪在風(fēng)味口感中具有特殊異臭味;三甲基惡唑具有強(qiáng)的霉腐氣味且口味略帶苦味;2－乙基－3，6－二甲基吡嗪具有霉味。因此，納豆特殊功效作用的物質(zhì)可能主要來源包括川芎嗪、三甲基惡唑、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出三種物質(zhì)總含量達(dá)到所得揮發(fā)性有機(jī)物含量的42.54%，這可能是具有特殊氨味的納豆重要營養(yǎng)成分。納豆中主要風(fēng)味物質(zhì)可能是具有特殊味道的川芎嗪、三甲基惡唑以及2－乙基－3，6－二甲基吡嗪所致，三者對產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)極大，其他含量極少物質(zhì)對納豆風(fēng)味影響的具體情況還有待研究。

3 結(jié)論與討論

本研究采用固相微萃取技術(shù)(SPME)結(jié)合GC－MS方法鑒定了日本納豆中的47種揮發(fā)性成分，其主要成分分別為:川芎嗪、2，5－二甲基吡嗪、2，3－丁二酮、三甲基吡嗪。而Tadayoshi Tanaka［13］對納豆的風(fēng)味成分分析采用單獨(dú)氣譜(GC)或氣相色譜－嗅探綜合(GC－sniffing)測試的采集技術(shù)，單獨(dú)質(zhì)譜(MS)或質(zhì)譜和保留系數(shù)(mass spectrum and retention index)的檢測方法共檢測出74種揮發(fā)性物質(zhì)，但百分含量超過0.01%的只有22種，且確認(rèn)了丙酮和異丁酸甲酯是其主要的風(fēng)味成分，含量分別高達(dá)70.84%和13.35%，其次是乙醇(7.35%)、異丁酸乙酯(2.51%)、噻吩(0.32%)等。兩方法都檢測出了乙醇、醋酸乙酯、丁酸乙酯等揮發(fā)性成分，但是含量最多的物質(zhì)存在較大差異，本研究中采用的SPME技術(shù)提香測定的成分吡嗪類化合物高達(dá)68.273%且酮類化合物含量只有17.87%，與日本學(xué)者的丙酮70.84%數(shù)據(jù)相差甚遠(yuǎn)，這與納豆采用工藝不同或者檢測方法不同有密切關(guān)聯(lián)，說明兩個揮發(fā)物提取方法的差異影響到揮發(fā)物的峰值，從而導(dǎo)致結(jié)果不同。

表1 納豆中揮發(fā)性有機(jī)物化學(xué)成分Table 1 Volatile organic components in natto

本研究表明納豆揮發(fā)性成分主要為嗪類、酮類化合物等，這些物質(zhì)對納豆揮發(fā)性成分形成的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)作用，因此，研究這些物質(zhì)可以為進(jìn)一步確定納豆風(fēng)味成分研究提供新思路，為更好地改善納豆風(fēng)味適合更多中國人的口味提供科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of volatile components from natto by solid－phase microextraction

HUANG Xuan1，LIAO Lu－yan1，F(xiàn)AN Lin2，3，BAI Liang1，LIANG Yi－bo1，JIANG Li－wen2，3，*
(1.Orient Science and Technology College of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China; 3.Hunan Provincial Engineering and Technology Research Centre for Fermented Food，Changsha 410128，China)

Objective:To analyze the natto in the main volatile components.Methods:Solid phase micro extraction and enrichment of volatile components in natto，a gas chromatography mass spectrometry(GC－MS)and its chemical components were identified，with the peak area normalization method to calculate the relative percentage of each component sub content.Results:Identified 55 kinds of chemical composition，47 kinds of volatile organic components of the total content of 80.49%，including pyrazines，pyrroles，pyridines，thiazoles，thiophenes，furans and sulfur components，aldehydes，ketones，alcohols，acids，esters，hydroxybenzenes，hydrocarbon.Conclusion: The main volatile components natto were Tetramethyl pyrazine(26.223%)，2，5－Dimethylpyrazine(23.835%)，2，3－Butanedione(15.648%)，Trimethylpyrazine(13.484%)，trimethyl－Oxazole(4.947%)，2－Ethyl－3，6－dimethylpyrazine(2.833%)，2－h(huán)ydroxy－1－methylethyl ester(1.803%)，2，3，5－Trimethyl－6－ethylpyrazine (1.758%)，3－h(huán)ydroxy－2－Butanone(1.676%)，Acetic acid ethenyl ester(1.377%)and so on.

natto;volatile components;solid－phase microextraction;gas chromatography－mass spectrometry (GC－MS)

TS207.3

A

1002－0306(2012)10－0058－04

2011－07－26 *通訊聯(lián)系人

黃璇(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

湖南省教育廳項目(DFCXS201006)。