郭麗瓊，田雪琴，蘇 霞，吳厚玖，曹秋旭，董文博

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715;2.西南大學(xué)柑橘研究所，重慶400712)

三聚氰胺對嗜熱鏈球菌生長影響的研究

郭麗瓊1，2，田雪琴1，2，蘇 霞1，2，吳厚玖2，*，曹秋旭1，2，董文博1

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715;2.西南大學(xué)柑橘研究所，重慶400712)

通過在MRS液體培養(yǎng)基里分別添加0‰、0.25‰、0.5‰、1‰、2‰、3‰及飽和的三聚氰胺，接種嗜熱鏈球菌，在42℃下培養(yǎng)48h，通過測定培養(yǎng)液的pH變化和計(jì)數(shù)細(xì)菌總數(shù)來考察三聚氰胺對嗜熱鏈球菌生長的影響。結(jié)果表明:嗜熱鏈球菌不能以三聚氰胺為氮源物質(zhì)而加以降解利用，三聚氰胺在水溶解度范圍內(nèi)對嗜熱鏈球菌的生長沒有促進(jìn)作用，只有微弱的抑制效果。

三聚氰胺，嗜熱鏈球菌，生長，影響

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，S.t) 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院提供;MRS培養(yǎng)基［4］;脫脂乳培養(yǎng)基 市售完達(dá)山脫脂奶粉復(fù)水溶解，分裝后于108℃滅菌15min;天友牌酸乳、完達(dá)山脫脂乳粉 市售;磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨、乙醇、葡萄糖、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳、氫氧化鈉 均為分析純;乙酸鈉、三聚氰胺 均為化學(xué)純;結(jié)晶紫染色液，碘液，0.5%番紅染色液，蒸餾水，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，瓊脂粉。

SW.CJ.1F無菌操作臺 蘇靜集團(tuán)安泰公司;HH B11電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海越近醫(yī)療器械廠;pHS－4C+智能pH計(jì)酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;ES－315高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司; B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司; DGX－9243 B－1電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有創(chuàng)新公司;FA2004電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化 先用酒精棉將菌種管玻璃表面擦拭消毒，而后于酒精火焰處打開管口，以滅菌鉑耳環(huán)取之，轉(zhuǎn)移入滅菌脫脂乳試管中。將上述接種完畢的脫脂乳試管置于42℃的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至凝固再移植到新的脫脂乳試管中，依此類推，傳代幾次，直至活力恢復(fù)到最佳，可據(jù)脫脂乳培養(yǎng)基的凝固時(shí)間而定［5－6］。

1.2.2 革蘭氏染色 活化后的菌種要進(jìn)行革蘭氏鏡檢，以便確認(rèn)菌種活力的回復(fù)與否以及是否被污染。

1.2.3 嗜熱鏈球菌對三聚氰胺的降解利用實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組:在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改變氮源，即將MRS培養(yǎng)基中的含N成分替換成不同濃度的三聚氰胺(2～6);對照組:缺N培養(yǎng)基(1)和標(biāo)準(zhǔn)MRS培養(yǎng)基(7)。各培養(yǎng)基主要成分如表1。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 The components of culture medium

將培養(yǎng)基配制完成后調(diào)節(jié)pH至6.8，分裝于試管，置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃高壓滅菌20min后冷卻待用。將培養(yǎng)于脫脂乳中的嗜熱鏈球菌按2%的接種量分別接種于上述培養(yǎng)基中，置于42℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，用酸度計(jì)測定pH。記錄數(shù)據(jù)，通過觀察對照組和實(shí)驗(yàn)組的酸度來定性分析三聚氰胺是否能被嗜熱鏈球菌用作N源。

1.2.4 三聚氰胺對嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸的影響 在完全MRS液體培養(yǎng)基中添加不同濃度三聚氰胺，調(diào)節(jié)pH至6.8，分裝后置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃高壓滅菌20min后冷卻待用。將培養(yǎng)于脫脂乳中的嗜熱鏈球菌按2%的接種量接種于其中，置于42℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。利用酸度計(jì)分別測定24h和48h時(shí)培養(yǎng)液的pH。確定三聚氰胺的作用后，重復(fù)上述操作，培養(yǎng)24h，每隔3h測定一次pH。記錄數(shù)據(jù)，通過觀察pH變化趨勢分析三聚氰胺對嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸影響。

1.2.5 菌落總數(shù)計(jì)數(shù) 將嗜熱鏈球菌接種于添加有不同濃度的三聚氰胺培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法對各培養(yǎng)液計(jì)數(shù)，同時(shí)觀察菌落形態(tài)及其大小并比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌的活化與鏡檢

通過鏡檢發(fā)現(xiàn)活化后的菌種為純菌，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 嗜熱鏈球菌對三聚氰胺的降解利用實(shí)驗(yàn)

根據(jù)現(xiàn)有資料可知乳酸菌的生長與產(chǎn)酸(即pH的下降)具有一定的正相關(guān)性［7］，因此，本實(shí)驗(yàn)通過測定發(fā)酵培養(yǎng)液中的pH變化來反映乳酸菌生長的情況。

按實(shí)驗(yàn)方法1.2.3配制各培養(yǎng)基，接種2%的嗜熱鏈球菌，42℃條件下培養(yǎng)48h后測定pH，數(shù)據(jù)如表2。

表2 以三聚氰胺為氮源的培養(yǎng)液的pH(n=3) Table 2 The pH of cultures with different concentrationsof melamine as nitrogen sources(n=3)

據(jù)表2可知，嗜熱鏈球菌在標(biāo)準(zhǔn)MRS液體培養(yǎng)基7中生長42h，pH降至3.20，說明嗜熱鏈球菌在該培養(yǎng)基中生長良好，產(chǎn)酸較好。但在去除了N源的培養(yǎng)基1中，嗜熱鏈球菌在培養(yǎng)42h后pH為5.16，較完全培養(yǎng)基高1.96，表明在無N源條件下嗜熱鏈球菌的生長明顯受到抑制。通過添加不同濃度的三聚氰胺后，與缺N培養(yǎng)液相比，其pH沒有下降反而有微弱的上升趨勢，最高達(dá)到5.88，表明在N源嚴(yán)重不足的情況下，三聚氰胺作為一種高氮化合物沒有被嗜熱鏈球菌所利用。故可判定三聚氰胺不能作為N源被嗜熱鏈球菌利用。

同時(shí)，隨著三聚氰胺濃度的逐漸增大，相應(yīng)培養(yǎng)液的pH由5.30逐漸上升至5.88，即嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸量在逐漸下降。初步判定三聚氰胺可能會(huì)抑制嗜熱鏈球菌的生長。

2.3 三聚氰胺對嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸的影響

2.3.1 三聚氰胺對嗜熱鏈球菌生長影響判定 由表3可知，24h時(shí)，添加了不同濃度三聚氰胺的完全培養(yǎng)基的pH為3.42～3.58，較對照組的3.36稍高，即實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)酸能力較對照組的稍低，說明三聚氰胺對嗜熱鏈球菌的生長并沒有促進(jìn)作用，而只有較弱的抑制作用;在三聚氰胺的水溶解度范圍內(nèi)，三聚氰胺濃度達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，其pH3.58最高，表明在飽和濃度時(shí)其抑制作用最強(qiáng)。

表3 添加不同濃度三聚氰胺的完全培養(yǎng)液發(fā)酵后的pH(n=3)Table 3 The pH of cultures with different concentrations of melamine(n=3)

此外，培養(yǎng)液的pH在24～48h間變化值(≤0.16)很小，說明嗜熱鏈球菌在0～24h內(nèi)已完成其生長周期。

2.3.2 三聚氰胺對嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸的影響 由圖1可知。

在三聚氰胺的水溶解度范圍內(nèi)，隨著其濃度的增大，培養(yǎng)24h后培養(yǎng)液的pH也在逐漸增大，表明三聚氰胺對嗜熱鏈球菌的抑制作用與其濃度具有一定的正相關(guān)性。

3～12h期間各培養(yǎng)液的pH下降速度較快，對照組pH變化值可達(dá)1.94，說明此時(shí)間段嗜熱鏈球菌的生長較為迅速，處于對數(shù)期;添加了三聚氰胺的培養(yǎng)液的pH下降速度和幅度都較對照的小，特別在3～6h期間表現(xiàn)尤為明顯，說明三聚氰胺的抑制作用主要發(fā)生在此期間。此外，由圖1可看出三聚氰胺的存在延長了嗜熱鏈球菌的生長延滯期，嗜熱鏈球菌的生長產(chǎn)酸受到部分抑制，且這種作用隨三聚氰胺濃度的升高而增加。而后在12～24h時(shí)間段內(nèi)，嗜熱鏈球菌的生長趨于穩(wěn)定，pH的下降速度也趨于穩(wěn)定。故三聚氰胺的抑制作用主要發(fā)生在嗜熱鏈球菌生長的初期。

圖1 添加不同濃度三聚氰胺的培養(yǎng)液發(fā)酵后的pHFig.1 Comparison of the pH of cultures with different concentrations of melamine

2.4 三聚氰胺對嗜熱鏈球菌菌落總數(shù)的影響

由圖2可知，隨三聚氰胺濃度的增加，嗜熱鏈球菌的菌落總數(shù)有所降低，但下降的數(shù)量不大，不超過200個(gè)菌落。通過對實(shí)驗(yàn)組和對照組上的菌落形態(tài)和大小進(jìn)行觀察和比較，結(jié)果表明添加三聚氰胺與否，嗜熱鏈球菌的菌落形態(tài)沒有發(fā)生顯著變化，但其大小有較明顯的變化，其中添加飽和濃度三聚氰胺的菌落直徑最小，說明飽和濃度的三聚氰胺對嗜熱鏈球菌的生長抑制作用最大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用含有不同濃度三聚氰胺的MRS培養(yǎng)基作實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，觀察三聚氰胺對嗜熱鏈球菌生長的影響。通過檢測發(fā)酵過程中pH、活菌數(shù)以及菌落形態(tài)的變化，利用顯微鏡觀察嗜熱鏈球菌的菌體形態(tài)來進(jìn)行分析。結(jié)果表明三聚氰胺不能作為N源被嗜熱鏈球菌所利用，相反對嗜熱鏈球菌的生長有不顯著的抑制作用。其抑制作用表現(xiàn)在生長初期，使嗜熱鏈球菌的延滯期延長，且效果隨三聚氰胺濃度的增加而更加明顯，三聚氰胺濃度達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)其抑制作用最強(qiáng)，而在生長的中后期不明顯。隨三聚氰胺濃度的增加，嗜熱鏈球菌的菌落總數(shù)有所降低，但下降的數(shù)量不超過200個(gè)菌落數(shù)。菌落大小隨三聚氰胺的濃度增大有所減小，特別是在飽和濃度時(shí)，菌落直徑比空白實(shí)驗(yàn)的菌落直徑小得多。故三聚氰胺對嗜熱鏈球菌的生長影響不大，在原料乳中添加三聚氰胺后并不能影響其發(fā)酵酸奶的作用。

圖2 添加不同濃度三聚氰胺培養(yǎng)液中嗜熱鏈球菌的菌落總數(shù)比較Fig.2 Comparison of the numbers of Streptococcus thermo philus in the medium added different concentrations of melamine

［1］李臣，周洪星，石駿，等.三聚氰胺的特性及其檢測［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2009(1):62－63.

［2］何綺霞.正確認(rèn)識三聚氰胺［J］.廣東飼料，2008，17(10): 32－34.

［3］郜洪濤，呂嘉櫪，閆肅，等.嗜熱鏈球菌對酸奶發(fā)酵的影響及應(yīng)用前景［J］.中國釀造，2010(11):5－9.

［4］GB/T 4789.35－2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)，食品中乳酸菌檢驗(yàn)［S］.

［5］王建芳，陳芳，靳亞平.嗜熱鏈球菌適宜培養(yǎng)條件研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17(2):56－58.

［6］曹榮安，韓建春，孔保華，等.巴西菇對嗜熱鏈球菌生長影響的研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(1):79－80.

［7］林召豐，王子龍，王志耕.酸奶在冷藏過程中酸度、粘度和雙乙酰的變化和關(guān)系研究［J］.包裝與食品機(jī)械，2009，27(3): 22－24.

Study on the effect of melamine on the growth of Streptococcus thermophilus

GUO Li－qiong1，2，TIAN Xue－qin1，2，SU Xia1，2，WU Hou－jiu2，*，CAO Qiu－xu1，2，DONG Wen－bo1
(1.Food Science College of Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Citrus Research Institute of Southwest University，Chongqing 400712，China)

MRS liquid mediums added respectively with 0‰，0.25‰，0.5‰，1‰，2‰，3‰and saturation concentration melamine were used to cultivate Streptococcus thermophilus.After 48h at 42℃in the culture medium，the impaction of melamine on the growth of Streptococcus thermophilus was tested through measuring the pH of the medium and calculating the final total number of bacteria.The experimental results showed that melamine couldn’t be used and degraded by Streptococcus thermophilus as a nitrogen and melamine within the water solubility couldn’t promote the growth of Streptococcus thermophilus while it had a little inhibition effect on the growth of it.

melamine;Streptococcus thermophilus;growth;effect

TS201.2

A

1002－0306(2012)10－0226－03

三聚氰胺是一種白色結(jié)晶粉末，含氮量高(約66.67%)，無異味。因利用常規(guī)方法不能檢測出其在食品和飼料中的添加量。為了提高奶制品的含氮量，不法商人將其添加到飼料原料和奶制品中，從而對人和動(dòng)物帶來危害［1］。自2008年9月我國發(fā)生的三鹿奶粉中“三聚氰胺”致嬰幼兒中毒的重大食品安全事故后，近來又相繼發(fā)生了多起乳制品中三聚氰胺含量超標(biāo)事件，對我國乳業(yè)產(chǎn)生了巨大沖擊。我國對乳中三聚氰胺的限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg;液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。但其標(biāo)準(zhǔn)水平不會(huì)設(shè)為“0mg/kg”，因?yàn)槿矍璋窌?huì)通過包裝材料或食物鏈富集作用存在于食品中［2］。嗜熱鏈球菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌［3］，屬于乳酸菌的一種，主要用于發(fā)酵工業(yè)，特別是酸乳的發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察三聚氰胺對嗜熱鏈球菌生長及產(chǎn)酸能力是否存在影響，判斷能否通過發(fā)酵酸奶的酸度變化來判定奶中三聚氰胺存在與否及其含量的大小。同時(shí)觀察奶中的三聚氰胺能否通過嗜熱鏈球菌的發(fā)酵作用來降解，從而使得奶中三聚氰胺含量降低。

2011－08－29 *通訊聯(lián)系人

郭麗瓊(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。