劉玲,賴術(shù),黎昀,黃忠仕*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001;2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

二苯乙烯苷對SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用△

劉玲1,賴術(shù)2,黎昀2,黃忠仕2*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001;2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

目的探討二苯乙烯苷(TSG)對老年癡呆模型SAMP8鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法6月齡SAMP8鼠50只，隨機(jī)均分為SAMP8空白組,陽性藥石杉堿甲對照組,高、中、低TSG組;6月齡SAMR1鼠10只為正常對照組。各組分別灌胃相應(yīng)藥物45 d后，采用Morris水迷宮方法，以逃避潛伏期、原平臺象限停留時間等指標(biāo)觀察其行為學(xué)改變。結(jié)果SAMR1組和TSG組在試驗(yàn)中逃避潛伏期明顯短于SAMP8空白組(P<0.05)。平臺象限的停留時間和穿越原平臺次數(shù)在探索試驗(yàn)中明顯多于SAMP8空白組(P<0.05)。可視平臺試驗(yàn)結(jié)果各組無差異。結(jié)論TSG能提高SAMP8鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

二苯乙烯苷；Morris水迷宮；老年性癡呆；學(xué)習(xí)記憶能力；快速老化小白鼠

老年性癡呆(AD)是一種原因未明，以認(rèn)知功能減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病?？焖倮匣Ｐ托“资?Senescence accelerated prone mouse/8,SAMP8)簡稱老化鼠，為一個較理想的衰老模型。SAMP8可以很好地模擬老年癡呆，其機(jī)制包括大腦皮層線粒體功能降低、海馬膽堿能神經(jīng)功能下降以及氧化應(yīng)激等[1]。二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,TSG)是何首烏中特有的生物活性成分，現(xiàn)代中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用[2-3]，TSG能顯著降低SAMP8鼠腦組織谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)含量,糾正SAMP8鼠腦區(qū)氨基酸類遞質(zhì)代謝的紊亂狀態(tài)，使興奮性和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)最終趨向平衡[4]。本研究通過觀察TSG對SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討TSG對老年性癡呆的防治作用，為今后治療、研究老年性癡呆提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SAMP8和SAMR1(Senescence accelerated-resistant mouse/1,正常老化小白鼠)，雄性，體重24～28 g,清潔級，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供(動物質(zhì)量合格證號：W2-J津?qū)崉淤|(zhì)M準(zhǔn)字第006號)。

1.2 藥物

TSG(桂林三寶藥業(yè)有限公司)，石杉堿甲(浙江震元制藥有限公司，批號：110203)。

1.3 儀器

Morris水迷宮(中國科學(xué)院藥物研究所)。Morris水迷宮由圓形水池、平臺和記錄系統(tǒng)3部分組成，水池直徑100 cm,高50 cm，內(nèi)壁黑色，水溫控制在(22±1) ℃。房間內(nèi)光線柔和而均勻，平臺位于水池等分的4個象限中的任意1個象限，且沒于水下1 cm。實(shí)驗(yàn)期間迷宮外參照物保持不變。一攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，自動采集動物游泳圖像，圖像自動采集和分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供)自動分析和處理。

2 方法

2.1 動物分組與喂養(yǎng)

選擇6月齡SAMP8雄性鼠50只,隨機(jī)分為SAMP8對照組、石杉堿甲陽性藥對照組、TSG高劑量組、TSG中劑量組、TSG 低劑量組，每組10只。另外，選擇6月齡SAMR1雄性鼠10只,作為SAMP8的模型對照組。各組均按0.2 mL·(10g)-1體重給藥。SAMP8對照組、SAMRl對照組：0.9%氯化鈉溶液20 mL·kg-1；陽性藥組：石杉堿甲0.02 mg·kg-1；TSG低劑量組：TSG 0.033 g·kg-1；TSG中劑量組：TSG 0.1 g·kg-1；TSG高劑量：TSG 0.3 g·kg-1。以上各組每日灌胃給藥l次，連續(xù)45 d。喂養(yǎng)結(jié)束后采用Morris水迷宮測試空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變。

2.2 行為學(xué)測試

2.2.1 隱蔽平臺試驗(yàn)(hidden platform trial) 每天在固定時間將小鼠面向池壁分別從入水點(diǎn)放入水中，記錄其在100 s內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期escape latency)，操作輕柔，避免不必要的應(yīng)激刺激。歷時5 d，每天3次，入池位置為平臺對面象限及所鄰2個象限的池壁中點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將最大潛伏期設(shè)為100 s,如果小鼠在100 s未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺上，停留30 s，逃避潛伏期記成100 s。采用每天第1次的水迷宮訓(xùn)練數(shù)據(jù)作為評價(jià)小鼠記憶力的指標(biāo)[6]。為避免小鼠直接看見平臺，在水中加入碳素墨水，每3 d換1次水。

2.2.2 探索試驗(yàn)(probe trial) 隱蔽平臺試驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除平臺，任選1個入水點(diǎn)將小鼠放入水中，記錄其100 s游泳軌跡，計(jì)算其在原平臺象限游泳時間和穿越原平臺次數(shù)。

2.2.3 反向試驗(yàn)(reversal trial) 將平臺位置移至對面象限，其余操作同隱蔽平臺試驗(yàn)，訓(xùn)練3 d。

2.2.4 可視平臺試驗(yàn)(visible platform trial) 最后1 d，讓平臺位置露出水面1 cm，其余操作同隱蔽平臺試驗(yàn)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS Statistics17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析(Analysis of variance ，ANOVA) 檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 隱蔽平臺試驗(yàn)

隱蔽平臺試驗(yàn)中的逃避潛伏期反映了動物空間記憶的獲得情況，即學(xué)習(xí)能力。試驗(yàn)第1天，采用第1次小鼠入水游泳數(shù)據(jù)，受到水的刺激大多數(shù)小鼠都繞著水池池壁游，數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過訓(xùn)練次數(shù)的增加，小鼠空間學(xué)習(xí)能力顯著升高，并通過空間學(xué)習(xí)建立起空間記憶[7]。從第2天起，SAMR1組的逃避潛伏期就明顯短于SAMP8組(P<0.05)，說明同一種系的正常老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比快速老化小鼠強(qiáng)。石杉堿甲組和TSG組逃避潛伏期也明顯短于SAMP8組(P<0.05)，表明用藥后能改善快速老化老鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。TSG組與陽性藥對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同組別隱蔽平臺試驗(yàn)逃避潛伏期比較

3.2 探索試驗(yàn)

探索試驗(yàn)是Morris水迷宮中較為敏感而精確的測試方法，測量動物的記憶保持能力。SAMR1組、石杉堿甲組和TSG組的停留原平臺象限時間和穿越原平臺次數(shù)均明顯多于SAMP8組(P<0.05)，說明正常老化小鼠和用藥后各組的記憶能力比快速老化小鼠強(qiáng)。見圖2。

圖2 不同組別的小鼠探索試驗(yàn)的結(jié)果比較

3.3 反向試驗(yàn)

反向試驗(yàn)主要反映動物的再學(xué)習(xí)能力，其實(shí)質(zhì)是動物習(xí)慣于原平臺位置的脫抑制過程。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過前面試驗(yàn)的訓(xùn)練，小鼠學(xué)習(xí)能力提高，反向試驗(yàn)第1天SAMR1組逃避潛伏期就明顯大于SAMP8組(P<0.05)。由圖3可見，SAMP8組、SAMR1組和石杉堿甲組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，TSG組分別與SAMP8組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。

3.4 可視平臺試驗(yàn)

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAMR1組、石杉堿甲組、TSG組的逃避潛伏期和SAMP8組比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即小鼠感覺、視覺或運(yùn)動功能方面的差異未對其空間學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生明顯的影響。見圖3。

圖3 不同組別小鼠反向試驗(yàn)和可視平臺試驗(yàn)逃避潛伏期的結(jié)果比較

4 結(jié)論與討論

何首烏為傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)肝腎，益精血，延緩衰老之功效。TSG是何首烏中的主要水溶性成分,近年來發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)保護(hù)作用[8]、降血脂及抗動脈粥樣硬化等作用,因此TSG可能對AD等神經(jīng)退行性病變的防治具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的檢測嚙齒類動物學(xué)習(xí)記憶能力的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，來觀察藥物TSG作用于SAMP8系小鼠后學(xué)習(xí)記憶的變化。讓動物利用遠(yuǎn)側(cè)暗示從起始位置游到水下隱匿平臺，通過重復(fù)訓(xùn)練來評估空間學(xué)習(xí)能力。當(dāng)水下平臺被撤出時，通過平臺象限偏愛來確定動物的參考記憶[9-10]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隱蔽平臺試驗(yàn)中SAMR1對照組、TSG組和石杉堿甲組逃避潛伏期均明顯短于SAMP8對照組，撤出平臺后在原平臺象限停留時間和穿越原平臺次數(shù)也大于該組。逃避潛伏期變短這說明小鼠的學(xué)習(xí)能力通過訓(xùn)練不斷地提高，撤出平臺后在原平臺象限停留時間長和穿越原平臺次數(shù)多則說明小鼠空間記憶能力的提高。反向試驗(yàn)測試的是小鼠再學(xué)習(xí)的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SAMR1組、TSG組和石杉堿甲組逃避

潛伏期明顯短于SAMP8組，即表明SAMR1組、TSG組和石杉堿甲組小鼠再學(xué)習(xí)能力明顯強(qiáng)于SAMP8組，更進(jìn)一步說明藥物TSG與陽性藥石杉堿甲有類似的提高小鼠空間記憶的能力，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明?？梢暺脚_試驗(yàn)各組試驗(yàn)結(jié)果差異不明顯，則表明各組間感覺、視覺或運(yùn)動能力無明顯差別。

通過對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的研究發(fā)現(xiàn)，TSG對快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損害有明顯的改善作用，為TSG的臨床新用途提供了參考。

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TSGonLearningandMemoryAbilitiesinSenescenceAcceleratedSAMP8Mouse

LIU Ling1, LAI Shu2, LI Yun2, HUANG Zhong-shi2

(1.GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China; 2.YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

Objective: To observe the effects of TSG on learning and memory abilities in senescence accelerated SAMP8 mouse.MethodsFifty SAMP8 at the age of 6th month were randomized into 5 groups: SAMP8 untreated control group, huperzine A control group, low-, mid- and high- dose groups of TSG, with 10 mice in each group. Another ten 6th month old SAMR1 mice were assigned to normal control group. After medication for forty-five days, Morris water maze test was used to assess the learning and memory abilities in each group.ResultsSAMR1 group escape latency is shorter than SAMP8 group significantly (P<0.05), it shows that SAMP8 group show obvious learning memory disorders. TSG treated groups significantly increased the time and times of swim in original platform quadrant in spatial probe test (P<0.05), and significantly shortened the escape latency in reverse platform quadrant test than SAMP8 group. There was no significant difference among each group in visual platform Test.ConclusionTSG could improve the learning and memory abilities in SAMP8 mice.

2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside (TSG); Morris water maze; Alzheimer’s disease; Learning and memory abilities; Senescence Accelerated Mouse SAMP8

廣西自然科學(xué)基金(桂科自0991281)

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黃忠仕，Tel：(0776)2851959，E-mail：hzs1004@163.com

2012-04-26)