王棟 賀西京 李浩鵬 王國毓 喬鴻飛

脊髓內(nèi)細(xì)胞移植是具有重要意義的脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）治療策略，為嚴(yán)重SCI的治療提供了新方法。嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cell，OEC）兼具中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和外周雪旺細(xì)胞的雙重特性，具有促進(jìn)軸突再生和髓鞘化的能力，被許多學(xué)者認(rèn)為是最理想的移植細(xì)胞，隨著OEC成功應(yīng)用于SCI基礎(chǔ)研究的深入，人們逐漸將重心轉(zhuǎn)移至探討OEC在臨床方面的應(yīng)用價值。本研究回顧性分析我院2005年9月至2010年3月共24例異體胚胎嗅球來源嗅鞘細(xì)胞移植治療的臨床資料，旨在探討其臨床療效。

資料與方法

一、病例選擇

接受嗅鞘細(xì)胞移植（olfactory ensheathing cells transplantation，OECT）患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)：（1）MRI顯示脊髓無明顯壓迫，脊柱穩(wěn)定性良好；（2）脊髓損傷平面穩(wěn)定半年以上，經(jīng)康復(fù)及其他治療無好轉(zhuǎn)及加重 ；（3）年齡 18～60 歲，性別不限 ；（4）無手術(shù)禁忌證。符合入選標(biāo)準(zhǔn)并已經(jīng)進(jìn)行移植的有24例，患者年齡19～45歲（中位年齡32.4歲），其中男20例，女4例。均有骨髓損傷后椎板減壓手術(shù)病史，不全癱14例，全癱10例。

治療措施包括：（1）手術(shù)治療：對于神經(jīng)影像學(xué)評估存在現(xiàn)階段手術(shù)適應(yīng)證者，進(jìn)行脊髓表面粘連松解。在獲得醫(yī)院倫理委員會同意，患者自愿簽署知情同意書后，進(jìn)行細(xì)胞移植治療。（2）藥物治療：營養(yǎng)神經(jīng)治療，預(yù)防深靜脈血栓，治療脊髓損傷并發(fā)癥。（3）康復(fù)治療：肌力訓(xùn)練，站立訓(xùn)練、行走訓(xùn)練、轉(zhuǎn)移訓(xùn)練等。

二、研究方法

1.嗅鞘細(xì)胞取材：移植所用的嗅鞘細(xì)胞來源于人體胚胎（孕12～16周）嗅球，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，并在家屬知情同意下獲取引產(chǎn)胚胎，將其置于75﹪的酒精中浸泡1 min，置于超凈工作臺上取材。經(jīng)囟門向前方沿正中線剪開顱骨至眉弓上方，然后沿眉弓平行線環(huán)形剪開顱骨，“T”字形打開前顱凹顱骨，將額葉向上翻起，暴露嗅球并取出，立即浸入4℃D-Hank液中沖洗，體視顯微鏡下去除軟腦膜及毛細(xì)血管網(wǎng)，剖開嗅球，用顯微器械去除嗅球中央灰質(zhì)部分，將剩余白質(zhì)部切碎，浸入0.25﹪的胰蛋白酶，37℃下培養(yǎng)箱中消化15 min，用20﹪胎牛血清的DMEM/F12終止 10 min，離心半徑 13.5 cm，1000 r/min × 3 min，棄去上清，再加入含20﹪胎牛血清的DMEM/F12終止，反復(fù) 2 次，將細(xì)胞濃度調(diào)整至 1 × 104/μl，接種于無包被的培養(yǎng)瓶中，采用改良的NASH差時壁法純化3次，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，5﹪CO2）培養(yǎng)。7 d后，細(xì)胞用胰蛋白酶分離，離心，清洗后濃縮成2 × 1010/L的濃度，以備移植之用（圖1），行免疫P75細(xì)胞化學(xué)染色以判定陽性細(xì)胞比例。

圖1 光學(xué)倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)7 d用于移植的人體胚胎嗅鞘細(xì)胞圖像(HE × 100)

2.細(xì)胞移植：手術(shù)前開始時聯(lián)系細(xì)胞培養(yǎng)人員消化細(xì)胞，消化時間約需半小時，消化完成后蠟封，帶入手術(shù)室。常規(guī)切開皮膚、沿手術(shù)瘢痕（椎板減壓手術(shù)史）外側(cè)顯露殘余椎板，從硬膜囊兩側(cè)及手術(shù)瘢痕區(qū)兩端打開椎管，顯露并打開硬脊膜，觀察并記錄脊髓損傷情況，分離脊髓損傷表面粘連。脊髓損傷區(qū)可見硬膜增厚，脊髓變細(xì)，色澤灰亮，質(zhì)地變硬，表面脊髓中央靜脈消失。在脊髓損傷區(qū)遠(yuǎn)、近端各0.5 cm處、兩側(cè)脊髓灰質(zhì)后角處，在手術(shù)顯微鏡下，定位，紫色5號頭皮針分別穿刺4個點(diǎn)，針頭直徑為0.5 mm，進(jìn)針深度約3 mm，連接10 μl微量進(jìn)樣器，前端吸入液體石蠟封閉，然后吸入細(xì)胞懸液，注射速度為1 μl/min，每點(diǎn)注射時間為 10 min，注射量 40 μl（每點(diǎn)10 μl），注射后留針2 min。共注入培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞 40 μl（細(xì)胞數(shù)量為 8 × 105個），細(xì)胞移植時間1 h（圖示2）。應(yīng)用2-0無損傷縫合線連續(xù)嚴(yán)密縫合硬脊膜，術(shù)中未見腦脊液漏出。沖洗傷口，硬膜外放置引流管，逐層縫合。

圖2 嗅鞘細(xì)胞移植術(shù)視野

細(xì)胞移植術(shù)后，常規(guī)進(jìn)行氣墊按摩床墊按摩，雙下肢靜脈泵擠壓等護(hù)理措施；全部患者均用營養(yǎng)神經(jīng)治療（神經(jīng)節(jié)苷脂鈉每天60 mg連續(xù)2周） ；應(yīng)用低分子肝素0.2 ml，每天2次連續(xù)2周，預(yù)防深靜脈血栓；均予以甘露醇125 ml，每天2次、地塞米松每天10 mg，連用3 d。預(yù)防及治療并發(fā)癥（如褥瘡、呼吸系及泌尿系感染等）。術(shù)后第二天開始脊髓損傷康復(fù)治療。

三、臨床療效評估

隨訪采用醫(yī)院門診復(fù)查、上門隨訪及必要的電話聯(lián)系相結(jié)合的方式，每3個月觀察1次患者損傷感覺平面的變化，損傷平面下肌力的變化，療效評估根據(jù)ASIA標(biāo)準(zhǔn)評估方法，胚胎嗅鞘細(xì)胞移植術(shù)前1周，采用美國脊髓損傷學(xué)會制定的ASIA評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行功能評價。主要觀察指標(biāo)：患者移植手術(shù)前、后ASIA評分，比較年齡、受傷時間、性別、損傷程度和損傷水平對胚胎嗅鞘細(xì)胞移植后功能恢復(fù)的影響。

移植手術(shù)前、后患者個人對于治療效果的評價。優(yōu)：患者對治療效果很滿意，某些關(guān)鍵感覺或肌肉力量恢復(fù)，痙攣發(fā)作次數(shù)減少或消失，肢體協(xié)調(diào)性改善；良：患者對治療效果較滿意，感覺平面下降，肌肉力量恢復(fù)但功能不具備，痙攣發(fā)作次數(shù)變化不明顯，肢體協(xié)調(diào)性未改善；可：患者對治療效果不滿意，未見明顯的感覺運(yùn)動恢復(fù)及痙攣協(xié)調(diào)性改善；差：患者對治療效果不滿意，出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞移植并發(fā)癥，或術(shù)后癥狀加重，感覺平面上升、肌力減退，痙攣發(fā)作次數(shù)增加，肢體運(yùn)動協(xié)調(diào)性下降。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。手術(shù)前后及隨訪期間ASIA評分結(jié)果比較采用隨機(jī)區(qū)組方差分析。根據(jù)患者主觀感覺進(jìn)行手術(shù)前后對比，計算優(yōu)良率。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞消化前進(jìn)行形態(tài)觀察，如果細(xì)胞形態(tài)良好，飽滿，呈雙極、三極細(xì)胞，細(xì)胞折光性好，胞核呈圓形位于細(xì)胞中央，突起細(xì)長編織成網(wǎng)狀，說明細(xì)胞活力良好，進(jìn)行消化移植應(yīng)用，P75免疫組化鑒定，陽性細(xì)胞濃度達(dá)90﹪。

患者手術(shù)時間平均1.7 h（1.5～2.5 h），術(shù)中平均出血量400 ml，術(shù)后平均住院時間12.6 d（10～21 d）。所有嗅鞘細(xì)胞移植后患者均得到隨訪，隨訪平均時間3.2年（0.5～5.2年）。

10例全癱患者中9例術(shù)后損傷感覺平面下降1～2個脊髓節(jié)段，運(yùn)動未見變化，1例患者損傷平面未見變化，痙攣癥狀在術(shù)后明顯減輕。

14例不全癱患者中10例的感覺平面下降2個節(jié)段，2例患者下降3個節(jié)段，其中1例患者的屈指功能改進(jìn)，并出現(xiàn)拇長伸肌的背伸運(yùn)動，肌力為2級。1例四肢癱患者術(shù)后出現(xiàn)四肢頻發(fā)性痙攣現(xiàn)象，MRI觀察未見器質(zhì)性病變，經(jīng)治療后未見明顯好轉(zhuǎn)。

患者自身對其所獲治療效果評價，優(yōu)：2例，良 ：9例，可 ：12例，差 ：1例 ；優(yōu)良率 ：46﹪?；颊呤中g(shù)前后ASIA評分結(jié)果詳見表1。

所有患者經(jīng)隨訪未發(fā)現(xiàn)明顯的手術(shù)并發(fā)癥，術(shù)后MRI檢查未發(fā)現(xiàn)移植局部的包塊形成或空洞。

表1 24例脊髓損傷患者行嗅鞘細(xì)胞移植手術(shù)前后運(yùn)動、痛覺、觸覺的ASIA評分結(jié)果

討 論

嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷的基礎(chǔ)研究報道較多，但臨床研究國內(nèi)報道較少，且療效不盡相同[1-4]。本文報道的方法，其治療過程及結(jié)果經(jīng)隨訪均較安全，未出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥。Alan等[5]將嗅鞘細(xì)胞移植患者后進(jìn)行了3年的評估，為了鑒別細(xì)小差異，評估內(nèi)容包括MRI、AIS評估、FIM、SCIM、神經(jīng)評估、SSEP、MEP和心理評估等。存在的問題是時間長了評審者的意見會出現(xiàn)傾斜，因此他們設(shè)計了未手術(shù)的對照組，評估者還是同一個人，并且他不知道患者情況及對照設(shè)立情況。治療組與對照組患者混合盲性評估，每3月進(jìn)行1次。研究病例較少每組3例。在3年后觀察到治療組沒有MRI改變，沒有諸如神經(jīng)痛、損傷平面以上的功能缺失。其中1個患者損傷平面以下的輕觸覺及針刺覺改善明顯，提示為ASIA的部分區(qū)域感覺改變。本研究結(jié)果提示部分患者改善，部分無效，1例加重。無效及癥狀加重的原因可能與以下方面有關(guān)：（1）患者損傷部位通過的神經(jīng)纖維較少，瘢痕較重，導(dǎo)致再生軸突的量及長度下降[6-9]；（2）細(xì)胞注射過程中對神經(jīng)纖維和神經(jīng)元的刺激或損傷[10]；（3）細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)量、胚胎的胎齡和取材條件時間等抑制細(xì)胞的問題均會對移植治療結(jié)果造成影響[11]；（4）注射部位的出血對脊髓神經(jīng)壓迫造成損傷[12-14]；（5）中樞性免疫反應(yīng)的影響，移植應(yīng)用的細(xì)胞未行細(xì)胞配型分析，是否引起免疫排斥反應(yīng)還有待研究，特別對于過敏體質(zhì)的患者[15]。

本研究采用ASIA分型的標(biāo)準(zhǔn)方法，并結(jié)合患者的主觀滿意度調(diào)查分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASIA評分改善明顯的患者，滿意度較高；反之，ASIA評分改善不明顯的患者，滿意度低；但有部分患者在ASIA評分未見明顯改善的情況下，滿意度較高。本研究分析主要有以下原因：（1）患者的痙攣發(fā)作次數(shù)及強(qiáng)度明顯降低，患者感到改進(jìn)明顯，滿意度高，但ASIA評分未能反映；（2）下頸椎損傷引起的頸髓損傷，患者ASIA評分改善不明顯，但患者關(guān)鍵肌肉力量的改善及運(yùn)動的出現(xiàn)，患者日常生活有質(zhì)的飛躍，患者感到滿意，滿意度較高。臨床研究不宜設(shè)立假手術(shù)組，建議將脊髓表面松解及松解后細(xì)胞移植進(jìn)行對比，患者易于接受。對于以后的SCI患者，筆者等將為其提供對照的評估。綜合以上情況，筆者建議將ASIA評分與痙攣分級、患者滿意度相結(jié)合，相互補(bǔ)充的評分方法。

對于病例入選標(biāo)準(zhǔn)，陳舊性損傷患者的狀況基本已經(jīng)穩(wěn)定，因此治療后功能改善的情況也就反映了治療方法的效果。

OECT治療的患者未取得顯著功能恢復(fù)，但治療過程安全，對部分患者可提供長久的神經(jīng)功能恢復(fù)?？茖W(xué)合理的評估方法有待建立。

志謝本研究的所有參與者；西安交通大學(xué)提供資金資助者

1 黃紅云,劉凱,黃文成,等.嗅鞘細(xì)胞促使脊髓挫裂傷后神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的研究[J].海軍總醫(yī)院學(xué)報,2001, 14(2):65-67.

2 黃紅云,王洪美,修波,等.嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷臨床試驗的初步報告[J].海軍總醫(yī)院學(xué)報, 2002,15(1):18-21.

3 Lu J, Féron F, Ho SM, et al. Transplantation of nasal olfactory tissue promotes partial recovery in paraplegic adult rats[J]. Brain Res, 2001, 889(19):344-357.

4 Vega Garcia-Escudero, Ana Garcia-Gómeza, Elena Lan,et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons[J]. Neuroscience Letters, 2012, 509(1):27-32.

5 Alan Mackay-Sim, James A, St John. Olfactory ensheathing cells from the nose: Clinical application in human spinal cord injuries[J]. Exp Neurol, 2011, 229(1):174-180.

6 黃紅云,陳琳,郗海濤,等.嗅鞘細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病1255例臨床分析[J].中國修復(fù)重建外科雜志, 2009, 23(1):14-20.

7 Fawcett JW, Curt A, Steeves JD, el al. Guidelines for the conduct of clinical trials for spinal cord injury as developed by the ICCP panel:spontaneous recovery after spinal cord injury and statistical power needed for therapeutic clinical trials[J]. Spinal Cord, 2007, 45(3):190-205.

8 Lopez Vales R, Fores J, Navarro X, et al. Chronic transplantation of olfactory ensheathing cells promotes partial recovery after complete spinal cord transaction in the rat[J]. Glia, 2007, 55(3):303-311.

9 Moreno Flores MT, Lim F, Martin Bermejo MJ, et al. Immortalized olfactory ensheat hing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons[J]. J Neurochem, 2003, 85(4):861-871.

10 Ramer LM, Au E, Richter MW, et al. Peripheral olfactory ensheathing cells reduce scar and cavity formation and promote regeneration after spinal cord injury[J]. J Comp Neurol, 2004, 473(1):1-15.

11 Verdu E, Garcia Alias G, Fores J. Effects of ensheathing cells transplanted into photochemically damaged spinal cord [J]. Neuroreport, 2001, 12(16):2303-2309.

12 Shi X, Kang Y, Hu Q, et al. A long-term observation of olfactory ensheathing cells transplantation to repair white matter and functional recovery in a focal ischemia model in rat[J]. Brain Res, 2010, 1317(4): 257-267.

13 Lipson AC, Widenfalk J, Lindqvist E, et al. Neurotrophic properties of olfactory ensheathing glia[J]. Exp Neurol,2003, 180 (2):167-171.

14 Kalincik T, Jozefcikova K, Sutharsan R, et al. Selected changes in spinal cord morphology after T4 transection and olfactory ensheathing cell transplantation[J]. Auton Neurosci, 2010, 158(8):31-38.

15 Richter MW, Roskams AJ. Olfactory ensheathing cell transplantation following spinal cord injury:Hype or hope[J]. Exp Neurol, 2008, 209(2):353-367.