李艷丹，黃艷菲，丁 玲，左 旭，劉 圓*

(西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041)

反相高效液相色譜法測(cè)定5種藏羌五加菜中金絲桃苷的含量

李艷丹，黃艷菲，丁 玲，左 旭，劉 圓*

(西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041)

目的：建立5種藏羌五加菜中金絲桃苷的反相高效液相色譜法含量測(cè)定方法，并比較其金絲桃苷的含量差異。方法：采用液相色譜-質(zhì)譜定性鑒別紅毛五加、糙葉藤五加和蜀五加中金絲桃苷。金絲桃苷提取物通過60%乙醇溶液回流提取105min制得；Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)、柱溫30℃，流動(dòng)相甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)355nm，流速1mL/min。結(jié)果：金絲桃苷在0.17～2.55mg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系，回歸方程Y＝2×106X＋1.94883×106(r＝0.9990，n＝6)。平均回收率100.31%，RSD為0.95%(n＝9)。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于五加菜質(zhì)量的控制方法研究。四川阿壩藏族羌族自治州、四川甘孜藏族自治州的五加屬植物中金絲桃苷含量：老葉遠(yuǎn)低于嫩葉；糙葉藤五加嫩葉(低溫烘干品)≈蜀五加嫩葉(低溫烘干品)＞紅毛五加嫩葉(低溫烘干品)＞無梗五加嫩葉(低溫烘干品)；糙葉藤五加的不同加工工藝：陰干＞茶葉＞烘干＞熱燙≈微波干燥≈曬干＞＞鹽漬＞凍藏1個(gè)月≈熱燙后凍藏1個(gè)月。

藏羌五加菜；金絲桃苷；反相高效液相色譜；液相色譜-質(zhì)譜；含量

在四川藏、羌族地區(qū)民間廣泛食用一類在當(dāng)?shù)胤Q為五加菜的嫩葉，認(rèn)為具有驅(qū)風(fēng)除濕、強(qiáng)壯筋骨的作用。當(dāng)?shù)夭?、羌族牧民一般將其直接炒食或煮湯或熱燙后涼拌食用或熱燙后家用冰箱冷凍保藏一年慢慢食用等。經(jīng)鑒定該類嫩葉為五加科五加屬植物紅毛五加Acanthopanax giraldii Harms、糙葉藤五加A. leucorrhigus var. fulvescens Harms & Rehd和蜀五加A. setchuenensis Harms ex Diels等同屬植物的嫩葉，三者均有作為五加皮類藥材的文獻(xiàn)記載；紅毛五加A. giraldii Harms主要分布于四川、甘肅、青海、寧夏等??；糙葉藤五加分布在湖南、廣東、廣西、四川等以莖皮或根入藥；蜀五加主要分布在四川和陜西等地，以莖皮入藥[1]。原主產(chǎn)于黑龍江省山區(qū)，現(xiàn)主產(chǎn)于東北的刺五加嫩葉開發(fā)成刺五加茶，并申請(qǐng)了相關(guān)的專利[2-4]，而四川藏、羌族地區(qū)五加屬植物的茶葉和相關(guān)食品研究和專利申請(qǐng)仍是空白，是極具開發(fā)價(jià)值和前景的新藥食同源植物，因此對(duì)四川產(chǎn)的藏羌五加菜的系統(tǒng)研究與開發(fā)利用具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和學(xué)術(shù)價(jià)值。金絲桃苷(hyperoside)是黃酮醇苷類化合物，結(jié)構(gòu)為槲皮素-3-半乳糖苷[5]，又名田基黃苷、海棠因，現(xiàn)代藥理研究[6-10]表明具有局部鎮(zhèn)痛、抗乙肝病毒、抗氧化作用，對(duì)肝臟、心肌、腦缺血損傷和腦梗塞等均有保護(hù)作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有調(diào)節(jié)活性，臨床上主要用于治療抗菌、抗炎、止咳、平喘、祛痰、心腦血管疾病等，近年來，將金絲桃苷開發(fā)用于治療抑郁、乙肝等疾病已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[11-12]。課題組前期對(duì)四川產(chǎn)紅毛五加進(jìn)行了比較系統(tǒng)的相關(guān)研究[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)擬先采用液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)紅毛五加、蜀五加和糙葉藤五加中的金絲桃苷進(jìn)行定性鑒別；進(jìn)而采用反相高效液相色譜(reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)測(cè)定并比較紅毛五加、蜀五加和糙葉藤五加的老葉、嫩葉及不同種嫩葉的不同加工工藝中金絲桃苷的含量，以期為藏羌五加菜新資源食品和功能食品開發(fā)、金絲桃苷的新來源和資源綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

無梗五加嫩葉由寬甸天奧短梗五加種植基地提供，是目前有市售的五加屬植物嫩葉，刺五加老葉自采于湖北省，其余樣品采自于四川阿壩藏族羌族自治州、四川甘孜藏族自治州，經(jīng)劉圓教授鑒定，具體來源信息見表1。各樣品均根據(jù)嫩葉的采摘方法，一般在10時(shí)左右。選擇形態(tài)整齊美觀、無斑點(diǎn)、無害蟲、有光澤的葉片進(jìn)行采摘。

1.2 試劑與儀器

金絲桃苷 中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

W2695 Separations Module高效液相色譜(W2996二極管陣列檢測(cè)器；Empower色譜工作站) 美國(guó)Waters公司；LCQ型質(zhì)譜儀 美國(guó)Finigan；Milli-Q超純水系統(tǒng)儀；AE240電子分析天平 梅特勒-托利儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工藝

烘干：將采摘的藏五加菜葉于40℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥48h，定期翻動(dòng)。

曬干：將采摘的藏五加菜置于日光白天溫度18～32℃下曬干，曬干處理持續(xù)2d，定期翻動(dòng)。

陰干：將采摘的藏五加菜放在陰涼通風(fēng)處干燥1個(gè)月，定期翻動(dòng)。

微波干燥：將采摘的藏五加菜放于家用微波爐(功率為900W)蔬菜鍵下中干燥7～15min。

熱燙或熱燙后冷藏：將采摘的藏五加菜置入沸水中，熱燙2～5min；晾涼后放入－18℃的冰箱中儲(chǔ)藏。

腌漬：采用干腌法。腌制前將藏五加菜晾半干。取一定量食鹽均勻撒在五加菜上，拌勻，使菜體中部分汁液外滲，擠出汁液。入缸時(shí)采用放一層菜加一層干鹽的方式，先在缸底鋪一層底鹽，再在鹽層上放一層蔬菜，壓緊，然后再撒一層鹽，再鋪一層菜，把菜體壓緊。如此反復(fù)，將菜腌至缸口，最后在菜體上面撒一層食鹽，再壓上重物，擠出滲出的汁液。腌制中要注意掌握，上層用鹽量比下層多一些。當(dāng)食鹽吸收菜體中的水分而溶化后，鹽水下淋，使鹽分均勻地滲入到原料中去。一般加鹽量應(yīng)為10%左右。

表1 5種五加屬植物來源(n=3)Table 1 Details of 5 Acanthopanax species tested in the present study

制茶葉：挑選出更嫩的藏五加菜嫩葉，去掉較老的葉柄。攤涼與萎凋：將采摘的五加新葉攤放開，定期輕翻動(dòng)2～3次，當(dāng)頂葉下垂并失去光澤、水分減少10%左右、手捏有彈性時(shí)即可。高溫殺青：殺青溫度為200～220℃，殺青時(shí)間為5～8min。揉捻：將殺青后的五加嫩葉采用輕、重、輕的原則，揉捻5～6min，使葉片卷成條索，破碎葉細(xì)胞擠出汁，粘附于葉表面，易于沖泡。烘干：將形成球形的藏五加葉茶用不銹鋼篩網(wǎng)盤裝好，厚度為2cm左右，置入烘干箱中烘干，溫度設(shè)定為60～70℃，時(shí)間4～5h。取出即得。

凍藏：將采摘的藏五加菜嫩葉直接放入－18℃冰箱中儲(chǔ)藏。

1.3.2 溶液的配制

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取金絲桃苷對(duì)照品適量，加乙醇配制成0.17mg/mL溶液。

供試品溶液制備：精密稱定藥粉(過40目篩)0.5g，置圓底燒瓶中，加入50mL 60%乙醇溶液，回流105min，取出，放冷，過濾，取續(xù)濾液，定容至50mL，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

1.3.3 儀器條件

質(zhì)譜條件為電噴霧電離源(electrospray ionization source，ESI)，鞘氣為N2，流速為30L/min；輔助氣為N2，流速為5L/min；霧化電壓3.5kV；毛細(xì)管電壓9.66V；毛細(xì)管溫度300℃；離子極性為負(fù)離子。Krosmasil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫30℃。流動(dòng)相為乙醇(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，程序?yàn)椋夯€(A:B＝30:70)、0～4min(A:B＝35:65)、5～18min(A: B＝40:60)、19～30min(A:B=50:50)；檢測(cè)波長(zhǎng)355nm，流速1mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 金絲桃苷質(zhì)譜分析

圖1 金絲桃苷紫外吸收譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of hyperoside

圖2 金絲桃苷質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of hyperoside

圖3 金絲桃苷對(duì)照品(A)和糙葉藤五加嫩葉低溫烘干品(B)色譜圖Fig.3 Mass spectra of hyperoside reference substance (A) and hyperoside extracted from low-temperature dried tender leaves of A. leucorrhizus (Oliv.) Harms var. fulvescens Harms & Rehd (B)

金絲桃苷紫外吸收見圖1、質(zhì)譜圖見圖2，金絲桃苷的[M－H]－為m/z 462.95。對(duì)照品及樣品溶液的色譜圖見圖3。

2.2 提取方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取糙葉藤五加嫩葉(烘干品)金絲桃苷含量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on determination of hyperoside content in low-temperature dried tender leaves of A. leucorrhigus var. fulvescens Harms & Rehd

分別精密稱取糙葉藤五加烘干品粉末(40目)0.5g，分別用40%、50%、60%、70%乙醇溶液50mL作提取溶劑，回流2h，最后定容至50mL，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得?？疾旖Y(jié)果見圖4，表明當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，樣品金絲桃苷提取率最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇60%的乙醇溶液作為提取溶劑。

2.2.2 提取時(shí)間的選擇

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)提取糙葉藤五加烘干品金絲桃苷含量的影響Fig.5 Effect of extraction time on determination of hyperoside content in hyperoside in low-temperature dried tender leaves of A. leucorrhigus var. fulvescens Harms & Rehd

分別精密稱取糙葉藤五加烘干品粉末(40目)約0.5g，加入60%乙醇溶液50mL，分別回流60、75、90、105、120min，最后定容至50mL，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得?？疾旖Y(jié)果見圖5，表明當(dāng)回流105min時(shí)，樣品金絲桃苷提取率最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為105min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系

按1.3.3節(jié)色譜條件，分別精密量取金絲桃苷對(duì)照品溶液1、2、4、6、10、15μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量/μg為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y＝2×106X －1.94883×106，R2＝0.9990。金絲桃苷線性范圍為0.17～2.55mg。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL(n＝6)，測(cè)得峰面積的RSD為0.99%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取樣品溶液10μL，分別于0、2、4、6、8、10h按1.3.3節(jié)色譜條件測(cè)定。按照金絲桃苷峰面積計(jì)算RSD為1.01%(n＝6)。結(jié)果表明樣品溶液在配制后10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取糙葉藤五加嫩葉低溫烘干品6份，按1.3.2節(jié)方法制備樣品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件測(cè)定。結(jié)果樣品中金絲桃苷的含量平均值為1.30%，RSD為1.12%(n＝6)，表明該分析方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定的樣品9份，每份1g，依次加入低、中、高3種質(zhì)量濃度金絲桃苷對(duì)照品溶液，按1.3.2節(jié)方法制備樣品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件測(cè)定。結(jié)果平均回收率為100.31%，RSD為0.95%(n＝9)。

2.4 樣品測(cè)定

按1.3.2節(jié)方法制備樣品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件測(cè)定，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 各樣品的金絲桃苷含量Table 2 Hyperoside contents in different samples

3 結(jié)論與討論

3.1 根據(jù)本課題組前期的研究[16]，金絲桃苷提取工藝為石油醚回流，再用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇回流提取的方法；本實(shí)驗(yàn)對(duì)所有嫩葉樣品進(jìn)行了相同的提取工藝對(duì)比，發(fā)現(xiàn)石油醚回流對(duì)嫩葉中金絲桃苷含量影響不大，因此考察用不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的溶液進(jìn)行、不同提取方法和不同的回流時(shí)間來提取樣品中金絲桃苷的含量，結(jié)果表明60%乙醇溶液回流提取105min對(duì)金絲桃苷的提取最完全。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：五加屬的老葉含量甚低，與課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)[16]結(jié)果一致，而嫩葉中的含量很高。糙葉藤五加嫩葉(低溫烘干品)≈蜀五加嫩葉(低溫烘干品)＞＞紅毛五加嫩葉(低溫烘干品)＞無梗五加嫩葉(低溫烘干品)，提示四川阿壩藏族羌族自治州、四川甘孜藏族自治州實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)的“五加菜”(尤其是糙葉藤五加)可以作為金絲桃苷的新來源，具有很好的開發(fā)前景。

3.3 不同加工方法對(duì)糙葉藤五加的金絲桃苷的含量的影響，從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：陰干＞茶葉＞烘干＞熱燙≈微波干燥≈曬干＞鹽漬＞凍藏1個(gè)月；茶葉的金絲桃苷含量較高，但是川產(chǎn)五加屬類植物的茶類產(chǎn)品仍然是空白，因此具有很大的市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。

3.4 不同加工方法的探討

3.4.1 當(dāng)?shù)夭?、羌族牧民一般將其直接炒食或煮湯或熱燙后涼拌食用或家用冰箱冷凍保藏一年食用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：熱燙后的藏羌五加菜金絲桃苷含量較高，提示該傳統(tǒng)食用方法具有科學(xué)性；藏羌五加茶葉金絲桃苷含量也較高，提示值得進(jìn)一步開發(fā)；家用冰箱冷凍保藏一年慢慢食用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：藏羌五加菜直接凍藏1個(gè)月之后，其金絲桃苷含量很低；熱燙之后再采用家用冰箱冷凍儲(chǔ)貯含量更低，可能因?yàn)槔鋬鰷囟燃铀倭私鸾z桃苷的降解，因此從金絲桃苷含量的變化來看提示該食用方法不一定科學(xué)，但是藏羌五加菜中除含有金絲桃苷外還含有其他多種生物活性成分，因此具體結(jié)論還有待課題組的進(jìn)一步系統(tǒng)綜合評(píng)價(jià)。

3.4.2 烘干、曬干、陰干均為食材干燥比較傳統(tǒng)的干燥方法，曬干和陰干受天氣影響較大，陰干雖然時(shí)間長(zhǎng)，但是對(duì)保存“五加菜”中的金絲桃苷效果很好；微波干燥方法簡(jiǎn)便、快捷，但會(huì)一定程度上降低五加菜的金絲桃苷含量。目前國(guó)內(nèi)對(duì)金絲桃苷在植物體內(nèi)的代謝研究較少，本工藝再次提示金絲桃苷在植物體內(nèi)的代謝有可能與溫度有關(guān)，過高或者過低的溫度都影響了金絲桃苷的含量。

3.4.3 按照傳統(tǒng)的鹽漬工藝加工結(jié)果表明：金絲桃苷含量很低，提示一定程度上鹽漬工藝破壞了藏羌五加菜的金絲桃苷活性成分，但是有待課題組進(jìn)一步的系統(tǒng)綜合評(píng)價(jià)。

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Determination of Hyperoside in Tibetan Acanthopanax Leaves from Five Species by RP-HPLC

LI Yan-dan，HUANG Yan-fei，DING Ling，ZUO Xu，LIU Yuan*
(Institute of Ethnic Medicine, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Objective: To establish a reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the determination of hyperoside in Tibetan Acanthopanax leaves from 5 different species. Methods: Hyperoside was identified by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Hyperoside in samples were extracted by refluxing with 60% ethanol for 105 min. The chromatographic separation was achieved on a Kromasil C18 column at 30 ℃ through gradient elution using methanol as mobile phase A and 0.5% phosphoric acid at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 355 nm. Results: A calibration curve equation describing the relationship between hyperoside concentration (Y) and peak area (X) was established as follows: Y＝2 × 106X ＋ 1.94883 (r＝0.990, n＝6). The calibration curve was linear over the concentration range of 0.17－2.55. The average spike recovery rate of hyperoside was 100.31% with a RSD of 0.95% (n＝9). Conclusion: A simple, accurate and repeatable method to determine hyperoside in Tibetan Acanthopanax leaves has been developed. Tender leaves of Tibetan Acanthopanax from the same species grown in Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture and Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Sichuan Province were found to be much richer in hyperoside than old ones. Low-temperature dried tender leaves of A. leucorrhizus (Oliv.) Harms var. fulvescens Harms & Rehd and A. setchuenensis Harms ex Diels had approximately equal hyperoside levels followed by tender leaves of A. giraldii Harms; tender leaves of A. sessiliforus Rupr had the lowest hyperoside level. Different drying methods were ranked in descending order from the highest to the lowest hyperoside content in dried A. leucorrhizus (Oliv.) Harms var. fulvescens Harms & Rehd as follows: shade drying ＞ processing into tea ＞ oven drying ＞ blanching ≈ microwave drying ≈ sun drying >> salting ＞1-month frozen storage ≈ 1-month frozen storage after blanching.

Tibetan Acanthopanax；hyperoside；RP-HPLC；LC-MS；content

R284.2

A

1002-6630(2012)16-0106-05

2012-01-16

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2012BAI27B07)；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011SZ0233)；四川省中醫(yī)藥管理局科技專項(xiàng)(2008-32)

李艷丹(1989—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槊褡逅幬?。E-mail：beanbean-li@hotmail.com

*通信作者：劉圓(1968—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槊褡逅幬铩-mail：yuanliu163@yahoo.com.cn