張傳津 都業(yè)良 彭媛芳 高迎春（①山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東 濟(jì)南 250022 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 青島）

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6種中藥提取物消除大腸桿菌耐藥性的研究

張傳津①都業(yè)良②彭媛芳②高迎春①*（①山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東 濟(jì)南 250022 ②青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 青島）

通過對15株致病性大腸桿菌耐藥譜的調(diào)查，采用濃度為1000mg/L的地錦草提取物、黃芩苷提取物、蒼術(shù)油、連翹提取物、雪膽提取物和十大功勞提取物對大腸桿菌作用20h，觀察作用前后大腸桿菌對6種抗生素的耐藥率的變化。耐藥譜調(diào)查結(jié)果顯示，10耐及10耐以上的大腸桿菌達(dá)80%。經(jīng)不同中藥提取液作用后，地錦草提取液具有比較好的耐藥性恢復(fù)作用，十大功勞、黃芩和雪膽提取物的效果次之，而蒼術(shù)油和連翹提取液并無恢復(fù)耐藥性的作用。說明部分中藥可恢復(fù)耐藥性大腸桿菌對抗生素藥物的耐藥性。

中藥提取物 大腸桿菌 耐藥性 地錦草

由于抗生素的不合理使用，細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，耐藥性的產(chǎn)生使治療細(xì)菌感染成為了嚴(yán)重困擾動物健康的問題。因此，人們千方百計(jì)地從不同途徑尋求克服細(xì)菌耐藥性的新方法[1]。20世紀(jì)80年代，中草藥和天然植物部分或全部恢復(fù)其對抗生素的敏感性成為當(dāng)今人們關(guān)注的焦點(diǎn)，為解決耐藥性問題提供了一條新途徑[2]。本文對地錦草提取物、黃芩提取物等6種中藥提取物的細(xì)菌耐藥性逆轉(zhuǎn)情況進(jìn)行了探索，為耐藥抑制劑的研發(fā)提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 試驗(yàn)器械

平皿、酒精燈、錐形瓶、玻璃棒、PH試紙、小試管、高壓鍋、電爐、電子天平、超凈臺、眼科鑷、酒精燈、接種針、培養(yǎng)箱、滅菌棉簽、冰箱、卡尺。

1.2 藥敏紙片

強(qiáng)力霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、氧氟沙星、氨芐青霉素、慶大霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、左氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、氟哌酸。均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑

MH瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 試驗(yàn)菌株

來自臨床禽源和豬源的15株已經(jīng)過鑒定的大腸桿菌，由山東省動物疫病防控中心提供。

1.5 中藥提取物

采用水提和醇提等方法共得到6種中藥提取物，分別是：地錦草提取物、黃芩苷提取物、蒼術(shù)油、連翹提取物、雪膽提取物和十大功勞提取物，并濃縮至每1ml含生藥1g，流通蒸汽滅菌后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 細(xì)菌耐藥譜的調(diào)查

2.1.1 制備接種菌液 選擇瓊脂平板上形態(tài)相似的菌落4~5個(gè)，用接種環(huán)挑其頂部，移至4~5ml營養(yǎng)肉湯。35℃培養(yǎng)至菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?，約1~2×108cfu/ml。

2.1.2 制備MH瓊脂 瓊脂厚度為4mm，約25~30ml。當(dāng)日使用或者放于2~8℃冰箱保持，保存時(shí)間不得超過7d。其pH為7.2~7.4。

2.1.3 接種平板 校正的菌液在15min內(nèi)使用。用滅菌棉簽蘸取菌液，在試管壁上擠壓除去多余液體，在固體培養(yǎng)基上均勻涂布，蓋好平皿，在室溫中放置5min，待平皿表面稍干后再放含藥紙片。

2.1.4 貼紙片 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼在涂有細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，均勻地貼在平皿離邊緣15mm處，紙片間的距離應(yīng)超過24mm。貼紙片時(shí)可輕壓，以保證與培養(yǎng)基密切接觸，紙片貼上后不可以再移動，因?yàn)榭咕貢詣訑U(kuò)散到培養(yǎng)基內(nèi)。

2.1.5 培養(yǎng) 平板35℃倒置培養(yǎng)16~18h。

2.1.6 觀察結(jié)果 觀察含藥紙片周圍有無抑菌環(huán)，并量其直徑(包括紙片直徑)大小，用毫米為單位記錄。

2.1.7 結(jié)果解釋 參考最新2009年1月份的K-B標(biāo)準(zhǔn)與杭州天和微生物試劑有限公司提供的部分標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 中藥提取物的耐藥性恢復(fù)試驗(yàn)

2.2.1 中藥最低抑菌濃度測定 將各種中藥稀釋成終濃度為1000mg/ml的藥液。采用試管二倍稀釋法對試驗(yàn)菌株進(jìn)行MIC試驗(yàn)。即取12支無菌試管編號，1~11號無菌試管各加入1×106CFU/ml菌液1ml，取1ml原藥液置于第1號試管中，均勻混合，繼而吸取1ml加入2號試管內(nèi)，依次類推稀釋至10號管，棄去1ml，第11號管作為不加中草藥液的菌液對照管，第12號管只加藥液1ml作為不加菌懸液的中草藥液對照管。搖勻后置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)耐藥大腸桿菌的效果測定 用營養(yǎng)肉湯分別將6種中藥提取液稀釋為低于MIC的藥液。分別挑取耐藥性大腸桿菌于各藥液中，分別培養(yǎng)20h后，用無菌棉簽沾取菌懸液涂布于M-H固體平板，根據(jù)抗生素的分類，選擇具有代表性的新霉素、氧氟沙星、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、阿莫西林和強(qiáng)力霉素6種藥敏紙片做藥敏試驗(yàn)。同時(shí)用無中藥肉湯培養(yǎng)基平行培養(yǎng)相同菌株作為對照。采用改良Kirby-Baller法[2]，按美國國立臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會2009年版的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 耐藥譜調(diào)查結(jié)果

結(jié)果顯示，15株致病性大腸桿菌對12種常用的抗菌藥物均有不同程度的耐藥。這些菌株中7耐、8耐和9耐各1株。絕大部分菌株都耐10種及10種以上的藥物，共有12株，占所有菌數(shù)的80% ，其中10耐的7株、11耐的1株、12耐的4株。

3.2 耐藥性恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 最低抑菌濃度測定結(jié)果 通過MIC法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最高濃度下，6種提取物稀釋液都有細(xì)菌增殖，說明5種中藥MIC都大于1000mg/ml。

3.2.2 中藥逆轉(zhuǎn)耐藥菌效果測定 結(jié)果詳見表1。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6種中藥提取液對大腸桿菌感觸培養(yǎng)后，耐藥率有不同程度的下降。地錦草提取液相對于其他中藥提取物具有較好的耐藥恢復(fù)作用。地錦草作用后，細(xì)菌對新霉素、氧氟沙星、頭孢氨芐和強(qiáng)力霉素的耐藥率都下降了6.67%。十大功勞、黃芩苷和雪膽提取物的效果次之。十大功勞作用后，細(xì)菌對新霉素和氧氟沙星的耐藥率都下降了6.67%。黃芩苷作用后，細(xì)菌對氧氟沙星的耐藥率下降6.67%，雪膽提取物作用后，細(xì)菌對強(qiáng)力霉素的耐藥率下降6.67%。而蒼術(shù)油和連翹提取液并無恢復(fù)耐藥性的作用。但所有中藥提取液都對環(huán)丙沙星和阿莫西林的耐藥性沒有恢復(fù)作用。

表1 六種中藥提取物逆轉(zhuǎn)耐藥性的結(jié)果

4 討論

監(jiān)測細(xì)菌的耐藥現(xiàn)狀和變化趨勢，進(jìn)而研究耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制并對耐藥性加以控制或消除，對臨床上更合理地用藥控制細(xì)菌性感染疾病的流行，生產(chǎn)安全的畜禽產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實(shí)和理論意義。本次試驗(yàn)中的15株菌株中對目前常用的抗菌藥物均全部耐藥，而10耐及10耐以上的“超級菌”達(dá)80%。表明本次所用的大腸桿菌對抗菌藥的耐藥已相當(dāng)嚴(yán)重，耐藥率普遍較高，多重耐藥也相當(dāng)嚴(yán)重。細(xì)菌耐藥性的形成有多方面的因素，有細(xì)菌本身固有的因素，更多的則是細(xì)菌在強(qiáng)大的抗生素選擇壓力下，逐步形成了能夠穩(wěn)定遺傳的耐藥特性。一個(gè)菌株可以同時(shí)具有多種耐藥機(jī)制，對一種抗生素的耐藥性也可以由不同的耐藥機(jī)制產(chǎn)生。因此，在臨床上應(yīng)該加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測，正確使用抗生素，同時(shí)加大對耐藥性抑制劑的研究。只有這樣才能有效控制耐藥菌的蔓延，減少耐藥菌帶來的危害，促進(jìn)畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

降低細(xì)菌耐藥性使其部分或全部恢復(fù)對抗生素的敏感性，對于臨床治療細(xì)菌感染具有重要意義。雖然很多試驗(yàn)證明蒼術(shù)、金銀花、黃芩、黃連、黃柏、敗醬草、魚腥草、紫草等通過消除R質(zhì)粒的方式來起到恢復(fù)耐藥性的作用[3]，但不同研究者對同種藥物和同種細(xì)菌的研究結(jié)果也存在較大的差異[4~6]，重復(fù)性較差。目前，中藥質(zhì)粒消除作用的具體成分及作用的機(jī)制還不清楚。通過本次試驗(yàn)的中藥逆轉(zhuǎn)耐藥菌效果可知，6種中藥恢復(fù)耐藥性的效果以地錦草提取物為最佳，其次是十大功勞、黃芩和雪膽提取物，無效果的是蒼術(shù)油和連翹提取物。

地錦草為一年生草本大戟科植物，全草含黃酮類、沒食子酸、內(nèi)消旋肌醇。中醫(yī)的作用主要是清熱解毒，活血，止血，利濕，通乳。也有治菌痢，腸炎，咳血，吐血，便血，崩漏，外傷出血等功效。由于地錦草的作用最好，建議繼續(xù)針對地錦草進(jìn)行中藥提取和耐藥性恢復(fù)試驗(yàn)。進(jìn)一步的改進(jìn)工藝，對中藥的提取成分進(jìn)行細(xì)化分析，針對性的進(jìn)行抑制細(xì)菌耐藥性的制劑的工藝研究，將有利于生產(chǎn)的提取和研發(fā)。

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（2012–03–31）

國家十一五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目:中獸藥現(xiàn)代化技術(shù)研究與開發(fā)，項(xiàng)目編號：2008BADB4B00。

S853.91

A

1007-1733(2012)07-0008-03