孫克剛 施建國(guó) 蔣宇丹

（上海禾豐制藥有限公司 上海 201206）

鹽酸異丙腎上腺素注射液和鹽酸腎上腺素注射液，主要成份分別為鹽酸異丙腎上腺素和鹽酸腎上腺素。兩者均為腎上腺素類(lèi)受體激動(dòng)劑，使心臟收縮力增強(qiáng)，心率加快，骨骼肌血管、支氣管平滑肌舒張。臨床上做為搶救藥，用于治療心源性或感染性休克、心搏驟停等。鹽酸異丙腎上腺素注射液[1]和鹽酸腎上腺素注射液[2]均為《中國(guó)藥典》2010年版二部收載品種，均采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)檢查，但色譜條件不同，為將兩個(gè)品種的檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)一，以方便生產(chǎn)檢驗(yàn)，本文在中國(guó)藥典提供的色譜系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，建立了同一種色譜條件測(cè)定鹽酸異丙腎上腺素注射液和鹽酸腎上腺素注射液的含量與有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD紫外檢測(cè)器，Sartorius CPA225 D電子天平。鹽酸異丙腎上腺素(山東科源制藥有限公司)；腎上腺素(武漢武藥制藥有限公司)；鹽酸異丙腎上腺素注射液(規(guī)格：2 ml∶1 mg)和鹽酸腎上腺素注射液(規(guī)格：1 ml∶1 mg)由本公司提供。乙腈、甲醇、庚烷磺酸鈉為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸異丙腎上腺素注射液的溶液制備

1)供試品溶液的制備。精密量取鹽酸異丙腎上腺素注射液適量，加0.1%焦亞硫酸鈉溶液制成20 μg·ml-1的溶液。

2)對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取鹽酸異丙腎上腺素對(duì)照品適量，加0.1%焦亞硫酸鈉溶液溶解并定量稀釋制成 20 μg·ml-1的溶液。

3)對(duì)照溶液的制備。精密量取鹽酸異丙腎上腺素注射液1 ml，置100 ml量瓶中，加0.1%焦亞硫酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。

2.2 鹽酸腎上腺素注射液的溶液制備

1)供試品溶液的制備。精密量取鹽酸腎上腺素注射液適量，加4%醋酸溶液制成0.12 mg·ml-1的溶液。

2) 對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取腎上腺素對(duì)照品適量，加4%醋酸溶液溶解并定量稀釋制成0.12 mg·ml-1的溶液。

3)對(duì)照溶液的制備。精密稱(chēng)取重酒石酸去甲腎上腺素對(duì)照品12 mg，置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成12 μg·ml-1去甲腎上腺素的溶液。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，精密加入供試品溶液5 ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

2.3 空白輔料溶液的制備

稱(chēng)取焦亞硫酸鈉適量，用4%醋酸溶液溶解并稀釋制成0.2 mg/ml焦亞硫酸鈉的溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Welch Materials C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-庚烷磺酸鈉溶液（取庚烷磺酸鈉1.76 g，加水溶解并稀釋至800 ml，搖勻）（1∶1∶ 8）。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：2.0 ml/min；柱溫：30 ℃。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取重酒石酸去甲腎上腺素對(duì)照品10 mg，加0.1 mol/L鹽酸5 ml使溶解，取1 ml，加30%過(guò)氧化氫溶液0.1 ml，搖勻，在紫外光燈（254 nm）下照射90 min，加流動(dòng)相9 ml，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液[3]。取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20 μl，注入液相色譜儀，除主成分峰外，應(yīng)有相對(duì)保留時(shí)間1.2和1.5的兩個(gè)降解峰，主峰及兩個(gè)降解產(chǎn)物之間的分離度均應(yīng)符合要求。理論板數(shù)按去甲腎上腺素峰計(jì)算不低于2 000（圖1）。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別取空白輔料溶液及兩種注射液的供試品溶液、對(duì)照品溶液各20 μl，進(jìn)樣，結(jié)果表明空白輔料不干擾鹽酸異丙腎上腺素和鹽酸腎上腺素的含量測(cè)定（圖2、圖3）。

圖2 鹽酸異丙腎上腺素注射液輔料、對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜圖

2.7 線(xiàn)性關(guān)系及范圍

分別精密稱(chēng)取鹽酸異丙腎上腺素適量，按“2.1 2)”配 制 成 10、16、20、24、32、40 μg·ml-1的 溶 液， 各取20 μl，按“2.4”項(xiàng)下測(cè)定，記錄色譜圖。以鹽酸異丙腎上腺素峰面積(X)對(duì)其質(zhì)量濃度(Y，mg·ml-1)進(jìn)行回歸，得鹽酸異丙腎上腺素回歸方程為：Y=5.935×103X-21.50，r=0.999 9。結(jié)果表明鹽酸異丙腎上腺素在10～40 μg·ml-1范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3 鹽酸腎上腺素注射液輔料、對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜圖

分別精密稱(chēng)取腎上腺素適量，按“2.2 2)”配制成60、96、120、144、192、240 μg·ml-1的溶液，各取 20 μl，按 “2.4”項(xiàng)下測(cè)定，記錄色譜圖。以鹽酸腎上腺素峰面積(X)對(duì)其質(zhì)量濃度(Y，mg·ml-1)進(jìn)行回歸，得鹽酸腎上腺素注射液回歸方程為：Y=1.142×104X+26.56，r=0.999 6。結(jié)果表明腎上腺素在60～240 μg·ml-1范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.8 檢測(cè)限的考察

按信噪比3∶1測(cè)得鹽酸異丙腎上腺素和鹽酸腎上腺素最小檢測(cè)限為 40.66 ng·ml-1和 44.12 ng·ml-1。

2.9 精密度試驗(yàn)

配制供試品溶液共6份，分別進(jìn)樣20 μl，鹽酸異丙腎上腺素注射液標(biāo)示量RSD值為0.44%，鹽酸腎上腺素注射液標(biāo)示量RSD值為0.09%。

2.10 回收試驗(yàn)

按處方量的80%、100%、120%并分別按“2.1”和“2.2”配制16、20、24 μg·ml-1的鹽酸異丙腎上腺素溶液和96、120、144 μg·ml-1鹽酸腎上腺素溶液，各取 20 μl，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算得鹽酸異丙腎上腺素的平均回收率為100.5%，RSD值為0.76%(n=9)；鹽酸腎上腺素的平均回收率為100.2%，RSD值為0.60%(n=9)。

2.11 含量測(cè)定

取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。將鹽酸異丙腎上腺素注射液三批和鹽酸腎上腺素注射液三批含量測(cè)定結(jié)果分別與《中國(guó)藥典》2010年版方法比較，差異不大(表1、2)。

表1 鹽酸異丙腎上腺素注射液三批含量測(cè)定結(jié)果

表2 鹽酸腎上腺素注射液三批含量測(cè)定結(jié)果

2.12 有關(guān)物質(zhì)的檢查

精密吸取空白輔料溶液、對(duì)照溶液、鹽酸異丙腎上腺素注射液各100 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰（扣除相對(duì)保留時(shí)間為0.07之前的輔料峰和溶劑峰），與輔料峰相鄰的最大色譜峰不得大于對(duì)照溶液主峰（鹽酸異丙腎上腺素）面積的10倍（10.0%）；其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的1.5倍（1.5%），其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2倍（2.0%）(表3、圖4)。

表3 鹽酸異丙腎上腺素注射液三批有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

圖4 鹽酸異丙腎上腺素注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖

精密吸取空白輔料溶液、供試品溶液、對(duì)照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。供試品溶液的色譜圖中如有與去甲腎上腺素峰保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過(guò)腎上腺素標(biāo)示量的1.0%。如有其他雜質(zhì)峰，扣除焦亞硫酸鈉峰、醋酸峰及之前的輔料峰，與輔料峰相鄰的最大色譜峰不得大于對(duì)照溶液中腎上腺素峰的峰面積(10%)，及其他各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對(duì)照溶液中腎上腺素峰面積的0.1倍(1.0%)(表4、圖5)。

表4 鹽酸腎上腺素注射液三批有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

圖5 鹽酸腎上腺素注射液有關(guān)物質(zhì)色譜圖

2.13 鹽酸異丙腎上腺素與鹽酸腎上腺素的同時(shí)測(cè)定

分別取鹽酸異丙腎上腺素注射與鹽酸腎上腺素注射液供試品溶液5 ml和1 ml，混勻，進(jìn)樣20 μl，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸異丙腎上腺素與鹽酸腎上腺素兩峰分離效果良好（圖 6）。

圖6 鹽酸異丙腎上腺素注射液與鹽酸腎上腺素注射液主峰分離色譜圖

3 討論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，本法與藥典法無(wú)差異，但本法同時(shí)適用于鹽酸異丙腎上腺素注射液、鹽酸腎上腺素注射液的含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查，方便生產(chǎn)上對(duì)腎上腺素類(lèi)產(chǎn)品的同時(shí)檢驗(yàn)。

參考《中國(guó)藥典》2010年版二部中鹽酸異丙腎上腺素注射液的流動(dòng)相：庚烷磺酸鈉溶液-甲醇（80∶20）（用1 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0），為使流動(dòng)相同時(shí)適用于鹽酸異丙腎上腺素和鹽酸腎上腺素，對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相比例為甲醇-乙腈-庚烷磺酸鈉溶液（1∶1∶8）時(shí)，主成分峰與雜質(zhì)峰的分離情況最好，故選用其為流動(dòng)相。紫外掃描圖顯示鹽酸異丙腎上腺素和腎上腺素均在280 nm波長(zhǎng)有最大吸收，因此選擇280 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。美國(guó)藥典[4]記載鹽酸腎上腺素注射液含量測(cè)定采用的色譜柱長(zhǎng)度為150 mm，流速采用2.0 ml/min，經(jīng)試驗(yàn)用柱長(zhǎng)為250 mm的色譜柱，主峰出峰都較晚，為25 min之后，故選擇采用150 mm長(zhǎng)度的色譜柱，流速采用2.0 ml/min。

鹽酸異丙腎上腺素與鹽酸腎上腺素分子結(jié)構(gòu)中均具有兒茶酚（鄰苯二酚）結(jié)構(gòu)，性質(zhì)不穩(wěn)定，接觸空氣或受日光照射，極易被氧化變質(zhì)，故制成注射液需加入焦亞硫酸鈉作為抗氧劑。但焦亞硫酸與鄰苯二酚易生成磺化物，雖可通過(guò)本文所研究的色譜方法對(duì)該磺化物進(jìn)行分析，但還須對(duì)該磺化物生成過(guò)程進(jìn)一步研究確認(rèn)，且在有必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的藥理毒理研究。

鹽酸異丙腎上腺素注射液和鹽酸腎上腺素注射液，光照、高溫破壞后降解產(chǎn)物較少，酸、堿、氧化破壞后均產(chǎn)生大量降解產(chǎn)物。但主成分與降解產(chǎn)物的分離度均符合要求，不干擾鹽酸異丙腎上腺素注射液和鹽酸腎上腺素注射液含量及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：2010 年版（二部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：701-702.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：2010 年版（二部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：460.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：2010 年版（二部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010： 571-572.

[4] The United States Pharmacopeial Convention .USP34-NF29[M]. Rockcille：The United States Pharmacopeial Convention，2011：2701.