樸玉蓮，沈 麗，韓 玲，崔勝云

（延邊大學(xué)，長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉 133002)

衍生化法測定水果中還原型谷胱甘肽（GSH）和總巰基含量

樸玉蓮，沈 麗，韓 玲，崔勝云*

（延邊大學(xué)，長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉 133002)

用衍生化試劑5，5－二硫硝基苯甲酸（DTNB）對巰基化合物的衍生化反應(yīng)和鄰苯二甲醛（OPA）與GSH的熒光衍生化反應(yīng)，分別采用UV－vis分光光度法和熒光光度法測定了獼猴桃、大棗、酸漿中總巰基含量和GSH的含量。被測樣品中GSH和總巰基相對含量分布有較大的差異，其中獼猴桃和大棗中含有相對較高的GSH濃度分布，分別達(dá)0.7092、0.8374mol/g，酸漿中含有較高的總巰基含量分布，達(dá)1.4173mol/g。本測定方法的回收率達(dá)95.38%～101.9%，滿足測定準(zhǔn)確度的要求，總巰基含量和GSH含量測定最低檢測限分別為9.6×10－7、2.69×10－7mol/L。

谷胱甘肽，巰基化合物，衍生化，5，5－二硫雙－2－硝基苯甲酸，鄰苯二甲醛

近年來，利用特有水果中的活性成分治療糖尿病、肥胖癥、代謝綜合癥等疾病受到人們的關(guān)注，這是因?yàn)槟承┧泻赜械纳锘钚晕镔|(zhì)[1]。迄今，水果中活性成分研究主要涉及各類維生素、礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、氨基酸和多酚類、活性糖類等[2－6]，但鮮見植物體內(nèi)廣泛分布的GSH和含巰基化合物含量的報(bào)道。眾所周知，植物體內(nèi)GSH、半胱氨酸、植物螯合素（PCs）、金屬硫蛋白等含巰基化合物不僅在植物自身生理中扮演至關(guān)重要的角色，而且也對其他生命體提供類似的生物活性，如抗氧化、抗癌、延緩衰老等[7－12]?？v觀植物樣品活性成分的測定，其樣品處理過程大多經(jīng)過細(xì)胞破壁、提取、分離、衍生化等分析前處理。由于GSH等巰基化合物的巰基具有還原性且其肽鍵也能發(fā)生水解作用，故在樣品前處理中相對苛刻的化學(xué)環(huán)境及氧化還原態(tài)的影響會導(dǎo)致其巰基氧化變性或肽鍵水解斷裂，無法得到完整的GSH和巰基化合物的含量信息。這是目前許多植物樣品還缺少GSH和巰基化合物含量信息的原因之一。本研究分別采用DTNB和OPA作為衍生化試劑，利用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的樣品前處理方法，用UV－vis分光光度法和熒光光譜法分別測定了獼猴桃、大棗、酸漿中總巰基含量和GSH的含量。本研究結(jié)果對GSH和巰基化合物含量信息及其活性地位、測定方法學(xué)研究提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

還原型谷胱甘肽 Aldrich公司；半胱氨酸 Appli Chem公司；同型半胱氨酸 Sigma公司；5，5－二硫雙－2－硝基苯甲酸（DTNB） 沃凱試劑公司；鄰苯二甲醛

國藥化學(xué)試劑公司；其他試劑 均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水 三次蒸餾水；水果樣品 市售鮮品，其中野獼猴桃和酸漿為長白山區(qū)新鮮采摘品，大棗為山東產(chǎn)，獼猴桃為新西蘭產(chǎn)。

RF－5301PC熒光分光光度儀 日本島津公司；UV－8500紫外分光光度儀 天美公司；KQ－500DE數(shù)控超聲波清洗器，UP－400S超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，Mini－10K微型離心機(jī)，AP－220ZN空氣泵，pHS－3C實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析原理 利用衍生化試劑5，5－二硫雙－2－硝基苯甲酸（DTNB）與巰基化合物、小分子巰基化合物和含巰基蛋白質(zhì)發(fā)生衍生化作用，皆生成在可見光區(qū)內(nèi)具有較強(qiáng)吸收的5－硫代－2－硝基苯甲酸（TNBA）鹽黃色陰離子，故利用分光光度法可測定總巰基含量[13－15]。利用OPA衍生化試劑與GSH選擇性衍生化作用生成三環(huán)熒光衍生化產(chǎn)物，用熒光分光光度法測定GSH含量[16]。利用含衍生化試劑的緩沖液作為提取液，采用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的前處理方法，其衍生化反應(yīng)原理見圖1。

圖1 巰基化合物與DTNB和OPA的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatizing reactions of slfhydryl compounds with DTNB and OPA

1.2.2 樣品前處理 分別取市售新鮮獼猴桃、野獼猴桃、酸漿、大棗，洗凈，去皮，瀝干。分別取瀝干后的樣品1.0g移入50mL具塞錐瓶中，分別加入20mL含過量DTNB（2×10－4mol/L）和OPA（1×10－4mol/L）衍生化試劑的0.02mol/L PBS緩沖溶液，用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)破壁5min，超聲波清洗儀振蕩40min，抽濾，取上清液。取10mL上清液，加入2倍體積乙醇，放置30min，在8000r/min離心除蛋白5min，取上清液作為光譜測定供試品。測定時(shí)取1mL樣品加入PBS緩沖液定容至10mL作為測試液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和畫圖及回歸分析是使用Origin數(shù)理統(tǒng)計(jì)和畫圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基化合物衍生化反應(yīng)光譜測定

DTNB與半胱氨酸和具有半胱氨酸殘基的多肽及蛋白質(zhì)的衍生化反應(yīng)時(shí)無選擇性，皆生成TNBA黃色離子[17]。為了探討本實(shí)驗(yàn)條件下巰基化合物與DTNB衍生化反應(yīng)的選擇性，分別選擇還原型谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（CySH）、同型半胱氨酸（HCySH）三種含巰基化合物，加入衍生化試劑OPA和DTNB，在PBS緩沖溶液中測定了熒光光譜和UV－vis吸收光譜，結(jié)果見圖2。

圖2 巰基化合物與OPA和DTNB混合溶液的熒光光譜圖和UV－vis吸收光譜圖Fig.2 Fluorescent and UV－vis spectra for the mixsture solutions of OPA and DTNB with sulfhydryl compounds

圖2－A的結(jié)果表明，只有GSH和OPA作用生成熒光衍生化產(chǎn)物并在激發(fā)波長為350nm時(shí)，在427nm處發(fā)出靈敏的熒光發(fā)射，而CySH和HCySH不與OPA生成熒光衍生化產(chǎn)物。圖2－B、C、D的結(jié)果表明，GSH和CySH與DTNB發(fā)生明顯的衍生化反應(yīng)并在λmax=417nm處出現(xiàn)強(qiáng)度幾近相同的吸收峰（吸光度分別為0.1565和0.1583），說明等量的GSH和CySH生成相同量的衍生化產(chǎn)物TNBA，而HCySH不出現(xiàn)衍生化作用生成的新的吸收峰。由于HCySH比起CySH在旁鏈巰基（－SH）前包含一個(gè)額外的亞甲基，這使巰基更接近羧基并發(fā)生分子內(nèi)縮合形成高半胱氨酸硫內(nèi)酯導(dǎo)致無法發(fā)生衍生化作用。圖2的結(jié)果說明，DTNB對半胱氨酸及GSH中半胱氨酸殘基中巰基衍生化反應(yīng)無選擇性，而OPA只與GSH發(fā)生選擇性衍生化作用。因此，利用DTNB衍生化試劑可測定包括GSH、CySH和含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的總巰基含量，利用OPA衍生化試劑可選擇性測定GSH含量。

2.2 OPA衍生化法測定樣品中GSH含量

利用OPA衍生化試劑，在測定熒光發(fā)射強(qiáng)度篩選10余種水果和藥用植物的基礎(chǔ)上，選擇獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿作為樣品，利用熒光光度法測定了它們GSH的含量。圖3為標(biāo)準(zhǔn)加入法測定得到的熒光發(fā)射光譜圖。

圖3 OPA樣品提取液及提取液中加入GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液后的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescent spectra for the OPA sample extracts before and after additon of GSH sdandard solutions

圖3結(jié)果表明，獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿的OPA提取液在λmax=427nm處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射。當(dāng)在該提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)系列的GSH溶液時(shí)，熒光發(fā)射強(qiáng)度與加入的GSH的濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）依次為：I=14.735+ 13.152C（r=0.9992），I=13.183+14.602C（r=0.9997），I= 18.646+12.628C（r=0.9995），I=10.365+17.185C（r= 0.9997）。根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法分別測定了檢測限。獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿的GSH測定檢測限分別為2.69×10－7、3.37×10－7、3.44×10－7、2.97×10－7mol/L。用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定樣品中GSH的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品中GSH的含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of GSH in the sample

2.3 DTNB衍生化法測定總巰基含量

利用DTNB作為衍生化試劑，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定了獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿中總巰基含量。DTNB的提取液和該提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)系列的GSH溶液后的UV－vis吸收光譜圖見圖4。

圖4結(jié)果表明，獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿提取液在λmax=417nm處具有明顯的吸收。當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)系列GSH溶液后其吸收強(qiáng)度與加入的GSH濃度呈良好的線性關(guān)系，對應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為：A=0.0306+0.0224C（r=0.9984），A=0.0282+0.0236C（r=0.9988），A=0.0658+0.0328C（r=0.9991），A=0.0498+ 0.0215C（r=0.9982），檢測限依次為9.7×10－7、1.98×10－6、7.20×10－5、4.71×10－6mol/L。利用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定了樣品中總巰基含量，結(jié)果見表2。

2.4 討論與分析

從表1、表2的測定結(jié)果比較中發(fā)現(xiàn)，不同的樣品其巰基化合物存在狀態(tài)有很大的不同。根據(jù)測定結(jié)果繪制了不同樣品的GSH、總巰基、總巰基與GSH含量差值分布圖，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，總巰基含量高低順序依次為；酸漿＞大棗＞獼猴桃＞野獼猴桃。獼猴桃、大棗具有相對較高的GSH濃度分布，而酸漿中非GSH的巰基化合物含量分布較高。通過干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10倍的維生素C、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸對GSH的測定無明顯的干擾，但甘氨酸對OPA與GSH衍生化產(chǎn)物的測定具有明顯的干擾使其測定結(jié)果偏低。

圖4 DTNB樣品提取液及該提取液中加入GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液后的UV－vis吸收光譜圖Fig.4 DTNB sample extracts before and after the addition of GSH sdandard solutions

圖5 樣品中各種巰基化合物含量分布圖Fig.5 Distribution graph of different thiol compounds

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，樣品前處理過程中衍生化反應(yīng)順序?qū)値€基含量測定具有重要的影響。因?yàn)?，利用含DTNB衍生化試劑的PBS緩沖液對樣品進(jìn)行超聲破壁、除蛋白后得到的樣品測定結(jié)果與先用緩沖液超聲破壁、除蛋白、再經(jīng)衍生化得到的樣品測定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者分析信號（吸光度）明顯大于后者。這一結(jié)果說明，細(xì)胞內(nèi)存在含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)成分且該蛋白質(zhì)中的巰基也可與DTNB作用生成有色的TNBA衍生化產(chǎn)物離子。因此，本實(shí)驗(yàn)采用含衍生化試劑的緩沖液進(jìn)行破壁、提取，再經(jīng)去蛋白的樣品前處理方法，可準(zhǔn)確測定樣品中包括含巰基蛋白在內(nèi)的總巰基含量。

3 結(jié)論

3.1 獼猴桃、大棗、酸漿中含豐富的GSH等含巰基化合物。其中酸漿和大棗不僅含豐富GSH外還含有豐富的其他巰基化合物，獼猴桃中含豐富的GSH含量。上述樣品所具有的抗氧化等生物學(xué)功能與其含有豐富的巰基化合物有關(guān)。

3.2 DTNB對GSH、CySH和含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)無選擇性。由于該分析方法是基于測定衍生化產(chǎn)物TNBA的吸收強(qiáng)度作為分析信號，因此通過含衍生化試劑的提取液與細(xì)胞破壁和衍生化為一體的樣品處理模式，可不受除蛋白的影響而測定包括含巰基蛋白在內(nèi)的總巰基含量。

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Reduced glutathione（GSH）and total thiol detection in some fruits by derivatizing methods

PIAO Yu-lian，SHEN Li，HAN Ling，CUI Sheng-yun*
（Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain＆Functinal Molecules，Ministry of Education Yanbian University，Yanji 133002，China）

Total thiol and reduced glutathione in Kiwi，Jujube and Fruit Physalis had been determined by UV-vis spectrometry and fluorescent spectrometry using 5，5-dithio-bis-nitrobenzoic acid（DTNB）and O-phthaldehde（OPA）as derivatizing agents.Relative amount between total thiol and GSH varies significantly，among which kiwi and jujube contained relative large amount of GSH with the content of 0.7092，0.8374mol/g respectively，while fruit physalis contained higher amount of total thiol with the centent of 1.4173mol/g.The determination of total thiol and GSH proceeded with the accurate and sensitive method with the recovery range of 95.38%～101.9%，and lowest detection limits reached to 9.6×10-7，2.69×10-7mol/L respectively.

glutathione；thiol compound；derivitize；5，5-dithio-bis-nitrobenzoic acid；O-phthaldehde

TS207.3

A

1002－0306（2012）20－0060－05

2012－08－01 *通訊聯(lián)系人

樸玉蓮（1987－），女，碩士研究生，研究方向：有機(jī)分析。

國家自然基金資助項(xiàng)目（21165021）。