牛 墨，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

復(fù)合發(fā)酵蘋(píng)果山藥果蔬汁優(yōu)良乳酸菌菌株的篩選

牛 墨，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

以蘋(píng)果山藥復(fù)合汁為基質(zhì)，對(duì)37株來(lái)源于發(fā)酵植物制品中的乳酸菌的發(fā)酵性能進(jìn)行初篩和復(fù)篩，從中篩選出產(chǎn)酸性能優(yōu)良的4株菌，分別為：發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、植物乳桿菌KLDS1.0715、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1。復(fù)篩確定發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1為最佳發(fā)酵菌種組合，并通過(guò)三因子單形重心設(shè)計(jì)方法確定三種菌種的最佳使用比例為4∶1∶2。

山藥，蘋(píng)果，發(fā)酵，乳酸菌

果汁、蔬菜汁是新鮮水果和蔬菜用壓榨或其他方法取得的汁液，由于直接榨汁加工的果蔬汁往往因缺少典型果香而影響市場(chǎng)拓展，將乳酸菌應(yīng)用于果蔬汁進(jìn)行乳酸發(fā)酵，不僅可提供愉快的呈味呈香物質(zhì)，賦予果蔬汁優(yōu)雅協(xié)調(diào)的乳酸發(fā)酵風(fēng)味，而且可產(chǎn)生人體所必需的多種氨基酸、維生素、消化酶等物質(zhì)，使果汁具有調(diào)節(jié)人體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡，提高鈣、磷、鐵的利用率，促進(jìn)鐵和VD的吸收，提高食物消化率和機(jī)體免疫能力等功效[1-3]。蘋(píng)果中富含糖類(lèi)、酸類(lèi)、芳香醇類(lèi)和果膠物質(zhì)，并富含多種礦物成分，是良好的生理堿性食品[4]。山藥原名薯蕷，是珍貴的藥、菜兩用食物，含有大量的黏蛋白并具有多種益生功能[5]。山藥和蘋(píng)果所含營(yíng)養(yǎng)成分豐富，對(duì)人體有益，且彼此的營(yíng)養(yǎng)成分又互相補(bǔ)充，因此開(kāi)發(fā)研究蘋(píng)果山藥乳酸發(fā)酵飲料既可使?fàn)I養(yǎng)更加均衡、全面、易吸收，又可避免因品種單一造成味道欠佳，是較佳的果蔬組合。Kyung[6-7]等人在2005年使用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和德氏乳桿菌發(fā)酵甜菜汁，2006年用植物乳桿菌、干酪乳桿菌和德氏乳桿菌發(fā)酵甘藍(lán)汁制得具有益生效果的甘藍(lán)乳酸菌飲料。2011年，Ana[8]等人利用干酪乳桿菌發(fā)酵蘋(píng)果汁制得益生菌飲料。王中鳳等[9]也提出，植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌均為優(yōu)良的果蔬汁乳酸發(fā)酵菌。但從產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速度、產(chǎn)品口感、香氣等綜合評(píng)價(jià)，多菌株混合共發(fā)酵最佳。本文主要對(duì)適于蘋(píng)果山藥復(fù)合果蔬汁發(fā)酵的乳酸菌進(jìn)行了篩選，對(duì)篩選出來(lái)的優(yōu)良發(fā)酵菌株進(jìn)行組合，優(yōu)選最佳菌株組合，并通過(guò)三因子單形重心設(shè)計(jì)法[10]確定最佳菌株間的比例，以期為蘋(píng)果山藥復(fù)合果蔬汁乳酸發(fā)酵飲料的研制提供優(yōu)良菌株和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥 市售（無(wú)霉?fàn)€變質(zhì));蘋(píng)果 市售國(guó)光蘋(píng)果（成熟，無(wú)腐爛);糖化酶 湖南省津市市新型發(fā)酵有限責(zé)任公司，酶活50000U/g;果膠酶 肇東市日成酶制有限公司，酶活30000U/g;檸檬酸、白砂糖 均為食品級(jí);供試菌株 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC)保存37株乳酸菌;乳桿菌的培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基[11];擴(kuò)培種子培養(yǎng)基[12]：復(fù)合果蔬汁（蘋(píng)果汁∶山藥汁=1∶1)+0.5%蛋白胨+0.5%牛肉膏。

九陽(yáng)多功能榨汁機(jī);DELTA-320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海)有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272 上海一恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;WY032T手持糖度計(jì)

成都萬(wàn)辰光學(xué)儀器;GYB-6S均質(zhì)機(jī) 上海華東高壓均漿機(jī)廠(chǎng);萬(wàn)用電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋(píng)果和山藥汁制備的工藝流程 山藥汁的制備[13]：山藥去皮、切片→0.2%檸檬酸水護(hù)色（90～95℃，5min)→加入3倍水置于搗碎機(jī)粉碎打漿→糊化（90～95℃，30min)→加入糖化酶糖化（55～60℃，3h)→滅酶（85℃，3min)→紗布過(guò)濾→均質(zhì)機(jī)均質(zhì)（20～25MPa，65～75℃)→山藥汁

蘋(píng)果汁的制備[14]：蘋(píng)果去皮、切片→0.2%檸檬酸水護(hù)色（90～95℃，5min)→加入3倍水置于搗碎機(jī)粉碎打漿→加入果膠酶（40～50℃，3h)→滅酶（85℃，3min)→紗布過(guò)濾→均質(zhì)機(jī)均質(zhì)（20～25MPa，65～75℃)→蘋(píng)果汁

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)的制備：將均質(zhì)后的山藥汁、蘋(píng)果汁用Na2CO3調(diào)pH到6.5左右，將山藥汁和蘋(píng)果汁按1∶1混勻，于90～95℃滅菌10min后作為發(fā)酵基質(zhì)備用。

1.2.2 菌株的活化及擴(kuò)培 乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中于37℃條件下培養(yǎng)20h左右進(jìn)行活化，活化2～3代后的菌株以6%的接種量接種于擴(kuò)培種子培養(yǎng)基中擴(kuò)培。

1.2.3 單菌株的初篩 將各供試菌株經(jīng)活化、擴(kuò)培后，分別以6%接種量接種于添加3%蔗糖的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)中，37℃發(fā)酵24h，在此期間每隔4h測(cè)一次滴定酸度和pH，選擇滴定酸度高、pH低的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.4 優(yōu)良單一菌株的復(fù)篩 將初篩獲得的菌株經(jīng)活化、擴(kuò)培后，分別以6%接種量接種于添加3%蔗糖的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)中，在37℃發(fā)酵16h，測(cè)定其滴定酸度和活菌數(shù)，計(jì)算產(chǎn)酸速率，選擇產(chǎn)酸速率快、活菌數(shù)高的菌株再確定最佳菌株組合。

1.2.5 最佳菌株組合的確定 將篩選出來(lái)的菌株經(jīng)活化、擴(kuò)培后，不同菌株間以相同比例按6%接種量接種于添加3%蔗糖的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)中，在37℃發(fā)酵14h，在此期間每隔2h測(cè)一次滴定酸度和pH。

1.2.6 發(fā)酵菌株間最佳比例的確定 采用混料設(shè)計(jì)中的三因子單形重心設(shè)計(jì)[11]優(yōu)化三種發(fā)酵菌種的使用比例，使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert 7.0.0，用y表示實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，A、B、C分別表示篩選出的最佳組合的3株菌（發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017、嗜酸乳桿菌LL1)在混合發(fā)酵劑中各占的百分比，確定發(fā)酵菌株間最佳比例，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按菌種間不同比例接種于復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)中，于37℃條件發(fā)酵14h后，分別測(cè)定滴定酸度。

1.2.7 分析方法 可溶性固形物：按GB/T 12143- 2008;pH：按GB/T12456- 2008;總糖、還原糖的測(cè)定：GB/T 5009.7- 2008;酸度：采用酸堿滴定法[15]。菌落總數(shù)：參照GB/T4789.35-2010進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮榨果蔬汁主要理化指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)1.2.7的分析方法測(cè)定鮮榨蘋(píng)果汁、山藥汁主要的理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鮮榨果蔬汁的理化指標(biāo)Table 1 The physical and chemical indexes of vegetable and fruit juice

2.2 優(yōu)良發(fā)酵菌株的初篩

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)經(jīng)37株乳桿菌分別發(fā)酵后，所獲得的pH及滴定酸度見(jiàn)表2和表3。

由表2、表3可知，由于蘋(píng)果山藥復(fù)合汁中含有一定量的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所有菌株隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液pH均呈下降趨勢(shì)，酸度相對(duì)呈上升趨勢(shì)，產(chǎn)酸量不斷增加。且在發(fā)酵12h時(shí)發(fā)酵液pH大多降至4.2以下，12h之后pH變化幅度較小，基本趨于穩(wěn)定;在發(fā)酵16h之后滴定酸度的變化幅度較小，基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明在12～16h之間可能產(chǎn)生了大量的有機(jī)酸，所以初步確定發(fā)酵時(shí)間為16h。

表2 不同菌株發(fā)酵蘋(píng)果山藥汁的pH變化Table 2 Changes of pH in apple and yam juice fermentation by different strains

續(xù)表

表3 不同菌株發(fā)酵蘋(píng)果山藥汁的滴定酸度的變化（°T)Table 3 Changes of the titration acidity in apple and yam juice fermentation by different strains（°T)

續(xù)表

表4 初篩獲得菌株在復(fù)合果蔬汁基質(zhì)中發(fā)酵的產(chǎn)酸速率及活菌數(shù)Table 4 The acid production rate and LAB activity of the apple and yam juice fermentation by the initial screening strain

如表3所示，各菌株在發(fā)酵過(guò)程中，KLDS1.0646、L33、KLDS1.0715、KLDS1.0719、LL1、KLDS1.9207、KLDS1.0732、KLDS1.0738、L4、KLDS1.1017等10個(gè)菌株在發(fā)酵16h時(shí)的產(chǎn)酸量較大，選擇這些菌株對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩。

2.3 優(yōu)良發(fā)酵菌株的復(fù)篩

將添加3%蔗糖的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)分別接種10株初篩菌株進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定其活菌數(shù)及滴定酸度，并計(jì)算產(chǎn)酸速率，結(jié)果見(jiàn)表4。

如表4可知，發(fā)酵性能最好的發(fā)酵乳桿菌為KLDS1. 0646;發(fā)酵性能最好的植物乳桿菌為KLDS1. 0715;發(fā)酵性能最好的瑞士乳桿菌為KLDS1. 1017;發(fā)酵性能最好的嗜酸乳桿菌為L(zhǎng)L1。對(duì)復(fù)篩獲得的株菌進(jìn)行配對(duì)組合，進(jìn)一步確定發(fā)酵菌種。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適合蘋(píng)果山藥復(fù)合汁乳酸發(fā)酵的優(yōu)良菌株分別為發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、植物乳桿菌KLDS1.0715、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1。菌株選擇是乳酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一，一般按下列條件進(jìn)行：具有生香性，無(wú)異味;產(chǎn)酸量高;對(duì)果蔬發(fā)酵適應(yīng)性強(qiáng)。植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌等均為優(yōu)良的蔬菜乳酸發(fā)酵菌[9]。

2.4 最佳菌株組合的確定

菌種在很大程度上決定了產(chǎn)品最終的口感風(fēng)味和其他特性。因此，使用多菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)乳酸發(fā)酵飲料，具有更廣闊的發(fā)展前景[16]。王中鳳等[9]也提出植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌均為優(yōu)良的果蔬汁乳酸發(fā)酵菌，從產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速度、產(chǎn)品口感、香氣等方面綜合評(píng)價(jià)，多菌株混合發(fā)酵最好。

對(duì)復(fù)篩獲得的4株發(fā)酵菌株分別按下列方式組合：KLDS1.0646+KLDS1.1017+KLDS1. 0715;KLDS1.0646+ KLDS1.1017+LL 1;KLDS1.0646+KLDS1.0715+LL 1;KLDS1.0646+KLDS1.1017+KLDS1.0715+LL1。每種組合分別按6%接種量（各組合中的菌株等比例)接種于添加3%蔗糖的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵基質(zhì)中37℃發(fā)酵16h，每隔2h分別測(cè)定滴定酸度及pH，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)合菌株37℃發(fā)酵蘋(píng)果山藥汁過(guò)程中滴定酸度（—)和pH（ )的變化曲線(xiàn)Fig.1 The change curve of the titration Acidity（—)and pH（ )in apple and yam juice during the processof fermentation on 37℃by compound strains

由圖1可知，菌株組合KLDS1.0646+KLDS1.1017+ LL1的產(chǎn)酸速度最快，最終的滴定酸度也比其他三組高。并且該組合的最終產(chǎn)酸量比三株單獨(dú)發(fā)酵菌株的都高，說(shuō)明三株菌共同發(fā)酵時(shí)有一定的共生作用。由于利用不同乳酸菌的生理生化特點(diǎn)，如對(duì)糖、蛋白質(zhì)、氧氣等的利用能力的不同，混合菌株發(fā)酵時(shí)可以互為對(duì)方提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，并達(dá)到代謝產(chǎn)物的互補(bǔ)。在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，使用混合菌種發(fā)酵明顯地優(yōu)于單菌發(fā)酵。研究表明，混合菌種要比單菌種發(fā)酵要好。并確定KLDS1.0646+KLDS1.1017+LL1為最佳發(fā)酵菌株。發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017、嗜酸乳桿菌LL1三株菌共同發(fā)酵比任何單一菌株發(fā)酵產(chǎn)酸量都高。由于本研究所選擇使用的發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646可顯著改善小鼠的β-Lg過(guò)敏癥狀[17]，所以確定的最佳發(fā)酵菌株具有一定的生理功效。

此外，圖1還表明，上述組合的發(fā)酵菌種在14h時(shí)產(chǎn)酸達(dá)到最大量，因此下面的實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵時(shí)間為14h。

2.5 復(fù)合發(fā)酵劑配比的優(yōu)化

采用三因子單形重心設(shè)計(jì)方法確定三個(gè)發(fā)酵菌株間最佳比例，根據(jù)單形重心實(shí)驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并測(cè)定結(jié)果，計(jì)算實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中三個(gè)因子的單形坐標(biāo)與滴定酸度之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 The design and result of experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of mean square deviation for regression model

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算的滴定酸度的響應(yīng)方程如下：

y=79.44A+58.94B+66.16C+17.85AB+38.79AC+ 5.99BC+104.43ABC （1)

由方差分析結(jié)果（表6)可知，所得模型極顯著（p＜0.01)，失擬項(xiàng)p=0.2323＞0.05，失擬不顯著，說(shuō)明該回歸模型是顯著的?；貧w方程與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，說(shuō)明響應(yīng)方程（1)模型建立成功。

為了檢驗(yàn)響應(yīng)方程的顯著性，對(duì)表7中實(shí)驗(yàn)的估計(jì)值和實(shí)測(cè)值之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，證明在置信度α=0.05，估計(jì)值和實(shí)測(cè)值之間無(wú)顯著差異，即估計(jì)值滿(mǎn)足實(shí)測(cè)值，回歸方程（1)在置信度α=0.05預(yù)測(cè)顯著。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 The design and result of verification experiments

根據(jù)回歸方程（1)可知，KLDS1.0646對(duì)滴定酸度的影響最大，而且LL1對(duì)滴定酸度的影響比KLDS1.1017大。因?yàn)镵LDS1.0646和LL1之間交互作用較大，說(shuō)明它們具有協(xié)同的共生作用。對(duì)響應(yīng)方程進(jìn)行線(xiàn)性規(guī)劃求解，得y的最大值為83.7921，相應(yīng)的編碼值為A= 0.579，B=0.127，C=0.294。根據(jù)編碼值，由公式（1)計(jì)算可得實(shí)際各菌株的比例，即三種發(fā)酵菌株的最佳比例為：KLDS1.0646∶KLDS1.1017∶LL1=4∶1∶2。

作為混合菌種，混菌比例對(duì)發(fā)酵速度有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用三因子單形重心設(shè)計(jì)法，通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)全面了解三者之間的比例變化對(duì)滴定酸度的影響，并確定三種菌種的最佳使用比例為4∶1∶2。

3 結(jié)論

從37株來(lái)源于發(fā)酵植物制品中的乳酸菌中篩選出4株能較好發(fā)酵蘋(píng)果山藥復(fù)合汁的菌種，分別為：發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、植物乳桿菌KLDS1.0715、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1。并確定發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017、嗜酸乳桿菌LL1三株菌共同發(fā)酵比任何單一菌株發(fā)酵產(chǎn)酸量都高，表現(xiàn)出一定的共生發(fā)酵特性。運(yùn)用三因子單形重心設(shè)計(jì)法確定三種菌種的最佳使用比例為4∶1∶2，以6%接種量接種于含3%蔗糖的蘋(píng)果山藥復(fù)合發(fā)酵基質(zhì)中，于37℃發(fā)酵14h后可獲得較好的發(fā)酵產(chǎn)品，以期為蘋(píng)果山藥復(fù)合果蔬汁乳酸發(fā)酵飲料的研制提供優(yōu)良菌株和理論依據(jù)。

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Screening of excellent LAB strains suitable for multi fermentation of the mixed apple and yam juice

Niu Mo，Meng Xiang-chen*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

In this experiment，the mixed juice with apple and yam was used as substrate，and the fermentation characteristics of 37 lactic acid bacteria strains isolated from fermented vegetable products were studied.Four strains including Lactobacillus fermentum KLDS1.0646，Lactobacillus plantarum KLDS1.0715，Lactobacillus helveticus KLDS1.1017 and Lactobacillus acidophilus LL1 with excellent ability of acid production were selected. The optimum combination were Lactobacillus fermentum KLDS1.0646，Lactobacillus helveticus KLDS 1.1017 and Lactobacillus acidophilus LL1，and the optimal proportion of strains was KLDS1.0646∶KLDS1.1017∶LL1=4∶1∶2，which was determined by simplex centroid design.

yam;apple;fermentation;lactic acid bacteria

TS255.44

A

1002-0306（2012)14-0242-06

2012－02－13 *通訊聯(lián)系人

牛墨（1987-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。