何偉峰，陳 萍，李春陽，張擁軍，*，林李潔，鄭鴦鴦，吳競東

(1.中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018;

2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014)

前處理條件對黑木耳膳食纖維測定的影響研究

何偉峰1，陳 萍1，李春陽2，張擁軍1，*，林李潔1，鄭鴦鴦1，吳競東1

(1.中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018;

2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014)

針對黑木耳膳食纖維的特性，采用AOAC推薦的酶－重量法和酶－化學(xué)法均沒有考慮非蛋白氮，不能準(zhǔn)確地測定黑木耳膳食纖維的含量。本文通過黑木耳中非蛋白氮的測定，對比AOAC Official Method 991.43法及該方法校正后對測定黑木耳膳食纖維的差異。首先以甲殼素為標(biāo)樣，測定其中的氨基糖回收率，確定微波消解樣品成游離氨基糖的最佳條件為鹽酸濃度8mol/L、鹽酸用量8mL、消解第一階段功率60W、消解60s，第二階段功率100W、消解120s;在此條件下處理黑木耳樣品后，參照AOAC 991.43法測定黑木耳膳食纖維含量時會造成3.18%的偏差。故測定含幾丁質(zhì)的食用菌類物質(zhì)的膳食纖維時需對AOAC方法進(jìn)行校正。

黑木耳，膳食纖維，前處理，檢測

黑 木 耳Auriculariaauricula(L.exHook.)Underwood，屬于擔(dān)子菌綱，木耳目、木耳科、木耳屬，為我國珍貴的藥用和食用膠質(zhì)真菌。我國是世界上生產(chǎn)黑木耳的主要國家，占世界黑木耳總產(chǎn)量的90%左右。黑木耳中總碳水化合物占子實體干重的70%以上，是一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維(dietary fibre，DF)來源。膳食纖維可分為水不溶性膳食纖維(insoluble dietary fibre，IDF)和水溶性膳食纖維(soluble dietaryfibre，SDF)兩部分，黑木耳不溶性膳食纖維包括幾丁質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素等，可溶性部分包括甘露聚糖、葡聚糖、酸性多糖等［1］。此外，黑木耳膳食纖維還包括一些微量成分，如黑色素、酚類化合物等［2］。黑木耳作為一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維源，在開發(fā)利用過程中，準(zhǔn)確的定量分析方法的建立是影響質(zhì)量、工藝和生物利用率的重要指標(biāo)。目前公認(rèn)的測定方法主要有以下三種:ADF/NDF法(即酸性洗滌纖維法和中性洗滌纖維法)，PROSKY法以及 ENGLYST法。其中ADF/NDF法是洗滌劑法測纖維的代表，自80年代初至今該法沒有得到更大發(fā)展;PROSKY法(AOAC法)為酶－重量法的代表，是目前公認(rèn)測定TDF、SDF和IDF含量的方法;ENGLYST法是酶－化學(xué)法的代表，其值被用于英國的食品標(biāo)簽中。由于黑木耳膳食纖維有著特殊的化學(xué)組成，不僅含有植物纖維，還含有動物纖維(細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì))，采用目前公認(rèn)的幾種膳食纖維測定方法都不能完全測定上述成分。Peter C－K Cheung［3］曾研究對比了采用酶－重量法和酶－化學(xué)法分別測定黑木耳膳食纖維的差別，發(fā)現(xiàn)采用酶－重量法法測定其總膳食纖維為(497 ±13)g/kg干重，酶－化學(xué)法為(421±11)g/kg干重，兩法差別較大。目前關(guān)于黑木耳膳食纖維準(zhǔn)確定量分析的研究還鮮有報道，本文通過黑木耳預(yù)處理方法的最佳條件摸索，獲得了幾丁質(zhì)中的游離氨基糖，確定了氨基糖的最佳測定方法，以期得到黑木耳膳食纖維較為準(zhǔn)確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌床木耳(新科241)子實體 購自浙江富來森食品有限公司，置于50℃烘箱烘干，粉碎，篩選孔徑為0.150～0.250mm的樣品，備用;硅藻土Celite 545 AW，No.C8656 Sigma;鉻酸洗滌液、MES－TRIS緩沖液、D－氨基葡萄糖鹽酸鹽、7%乙酰丙酮(3.5mL乙酰丙酮，溶于50mL 1.2mol/l碳酸鈉溶液)、Ehrlich試劑(DMAB，1.333g DMAB溶于25mL無水乙醇及25mL濃鹽酸的混合液)、乙醇、丙酮 均為分析純。

粉碎機(jī) 江蘇南京;AL04型電子天平 梅特勒－托利多有限公司;DHG－9240A型鼓風(fēng)干燥箱 河南鄭州;T6新世紀(jì)分光光度儀 北京;陶瓷纖維馬福爐SX2系列、XT－9900型消解爐、KDY－9820型凱氏定氮儀 上海;膳食纖維測定系統(tǒng)，包括 CSF6、MULTISTIRRER6及GDE酶消化組件 意大利VELP SCIENTIFICA Co.。

1.2 實驗方法

1.2.1 成分分析 粗脂肪含量:參照GB/T15674－2009;灰分含量:參照GB/T5009.4－2010;粗蛋白含量:參照GB/T15673－2009，其中總氮含量需要扣除氨基糖含量;總碳水化合物含量(%)=［100－(水分+粗蛋白質(zhì)+灰分+粗脂肪)］%。

1.2.2 氨基糖的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以D－氨基葡萄糖鹽酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品，參照Elson＆Morgan法［4］測定，即吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)于25mL具塞試管中，補(bǔ)水至2mL，加入乙酰丙酮溶液1mL，沸水浴30min，冷卻，加入2mL無水乙醇與1mL對二甲氨基苯甲醛試劑，振蕩后，加入4mL無水乙醇，60℃水浴1h，冷卻，在530nm處比色，根據(jù)所測得的吸光度及對應(yīng)的糖質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 前處理條件摸索 a.水解法與微波消解法對樣品消解的影響:將0.10g甲殼素在6mL 6mol/L HCl下溶解16h，然后在100℃水解45min處理后采用Elson＆Morgan法測定氨基糖。同時取相等量的甲殼素加入6mL 6mol/L HCl，用微波消解儀消解，第一階段功率60W消解60s，第二階段功率100W消解120s，處理后采用Elson＆Morgan法測定氨基糖。

b.鹽酸濃度對樣品消解的影響:準(zhǔn)確稱取0.10g甲殼素4份于消化管，分別加入6、8、10、12mol/L HCl各6mL，用微波消解儀消解，第一階段功率60W消解60s，第二階段功率100W消解120s，處理后采用Elson＆Morgan法測定氨基糖。

c.鹽酸用量對樣品消解的影響:準(zhǔn)確稱取0.10g甲殼素7份于消化管，分別加入6mol/L鹽酸2、3、4、5、6、7、8mL，用微波消解儀消解，第一階段功率60W消解60s，第二階段功率100W消解120s，處理后采用Elson＆Morgan法測定氨基糖。

d.微波消化時間對樣品消解的影響:取0.10g甲殼素，加入6mL 6mol/L HCl，第一段水解時間固定為60s，分別控制第二段消解時間為60、90、120、150、180、210、240、270、300s，處理后采用Elson＆Morgan法測定氨基糖。

轉(zhuǎn)化率計算公式:

氨基糖轉(zhuǎn)化率(%)=W1/W2×100

其中，W1指消解后氨基糖含量(g)，W2指樣品甲殼素重量(g)。

1.2.2.3 預(yù)處理工藝的因素水平確定 根據(jù)單因素預(yù)實驗的最適條件范圍，按照正交實驗設(shè)計三個因素，即鹽酸濃度、鹽酸體積、消解時間，采用L9(34)因素與水平進(jìn)行條件優(yōu)化，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.2.4 黑木耳中氨基糖的測定 樣品經(jīng)微波消解儀在最優(yōu)條件下消解，然后用NaOH溶液中和消解液，再將消解液移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容，混合均勻后，消解液經(jīng)濾紙過濾，收集儲存。取2.0mL過濾的消解液于帶塞試管中，加入乙酰丙酮試劑1.0mL，沸水浴30min，冷卻后，慢慢加入2.0mL無水乙醇，然后加入1.0mL DMAB，振蕩均勻。再加入4.0mL無水乙醇，60℃下保溫1h，以試劑空白為參比，在紫外分光光度計530nm處測定吸光度，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程求出黑木耳中氨基糖的含量，并折算成含氮量(N)。

1.2.3 膳食纖維的測定 準(zhǔn)確稱取(1.000±0.0020)g樣品置于500mL燒杯中，加入40mL pH8.2的MESTRIS緩沖液，用磁力攪拌直到樣品完全分散。參照AOAC Official Method 991.43，其中蛋白質(zhì)的計算扣除氨基糖中的含氮量?？偵攀忱w維(TDF)與IDF均采用下式計算:

式中，X為TDF或IDF含量(%);R為殘留物重量(mg);P1、P2和A分別為粗蛋白質(zhì)、非蛋白氮、灰分重量(mg);M為樣品的重量(mg)。

SDF(%)=TDF(%)－IDF(%)

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳子實體的營養(yǎng)成分

黑木耳子實體中的主要營養(yǎng)成分見表2。

表4 鹽酸濃度對樣品消解的影響Table 4 Effect of hydrochloric acid concentration on sample dissolution

表5 鹽酸用量對樣品消解的影響Table 5 Effect of the amount of hydrochloric acid on sample dissolution

表6 消解時間對氨基糖轉(zhuǎn)化率的影響Table 6 Effect of the microwave dissolution time to the conversion ratio of amino sugar

表2 黑木耳子實體的主要營養(yǎng)成分(以干物質(zhì)計)Table 2 The main nutritional components of the Auricularia auricular(In dry matter)

由表2可知，黑木耳子實體的營養(yǎng)成分主要以碳水化合物以主，其次是蛋白質(zhì)，還含有一定量的礦物元素及少量的脂肪類物質(zhì)。其中碳水化合物的測定結(jié)果與Peter CK Cheung［3］的文章很相似?；曳值慕Y(jié)果差異較大，原因較難推測，有可能是樣品受到污染，或者樣品灰化時不徹底，或者品種不同造成。另外，黑木耳中脂肪含量較低，進(jìn)行膳食纖維測定時，可以不需要進(jìn)行脫脂處理。

2.2 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)測定結(jié)果，用excel進(jìn)行擬合得D－氨基葡萄糖鹽酸鹽含量(μg/mL)與吸光度A間的回歸方程:Y=0.0059X+0.014(R2=0.9961)結(jié)果見圖1。

圖1 D－氨基葡萄糖與吸光度間的線性關(guān)系Fig.1 The linear relationship between the absorbance and the D－glucosamine

2.3 氨基糖測定的最佳條件

2.3.1 水解法與微波消解法 兩種方法測定結(jié)果見表3。

由表3可知，水解法和微波消解法處理樣品后，測定氨基糖得率無明顯差異。從處理后殘渣觀察，還存在一些淡黃色沉淀，說明兩種處理方法都沒有使樣品充分的水解，與表中的實驗數(shù)據(jù)相符。由于水解法耗時較長，以下實驗選擇微波消解法。

表3 兩種預(yù)處理方法對樣品消解的影響Table 3 Effect of two different pretreatments on sample dissolution

2.3.2 鹽酸濃度對樣品消解的影響 不同濃度鹽酸(體積恒定)對甲殼素樣品消解的結(jié)果見表4。

從表4可以看出，在料水比不變的情況下，加入8mol/L的鹽酸，甲殼素水解最充分，測得氨基糖的轉(zhuǎn)化率最高。鹽酸濃度過高，容易造成樣品炭化而使測定值偏低。

2.3.3 鹽酸用量對樣品消解的影響 不同用量鹽酸(8mol/L)對甲殼素樣品消解的結(jié)果見表5。

從表5可知，隨著鹽酸加入體積的增加，氨基糖含量值增加，當(dāng)體積達(dá)到6mL，氨基糖的含量值達(dá)到較高值，并且隨著鹽酸體積增加基本保持平衡，說明此時鹽酸體積已經(jīng)不是消解的限制因素。

2.3.4 微波消解時間對樣品消解的影響 不同消解時間甲殼素樣品消解的結(jié)果見表6。

從表6可以看出，隨著總消解時間(第一階段為60s不變)的增加，氨基糖得率也增加，并在240s時達(dá)到最高值，時間再加長，氨基糖測定值反而下降。為微波消解儀不能直接控制消解溫度，隨著消解時間增長，消解管內(nèi)溫度過高，使樣品炭化現(xiàn)象明顯，造成損失。實驗選取90、120、150s做正交實驗。

2.3.5 微波消解最優(yōu)條件確定 在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計3水平3因素正交實驗，實驗結(jié)果見表7。

由表7可知，極差最大的為A因素，其次為B、C因素，說明A因素即鹽酸濃度的改變對樣品消解效果的影響最大，其次為鹽酸用量、消解時間，綜合各因素k值和直觀比較得出最佳組合條件為A2B3C2。由于鹽酸用量與消解時間對實驗結(jié)果影響較小，從實際效果考慮，確定消解的最佳條件為:鹽酸濃度8mol/L、鹽酸用量8mL、消解時間120s。一步在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證實驗，共進(jìn)行3次實驗，所得結(jié)果平均為84%。因此，以下實驗中氨基糖測定選擇在此條件下對樣品進(jìn)行消解。

表7 正交實驗結(jié)果Table 7 The result of orthogonal experiment

2.4 黑木耳膳食纖維的測定

參照AOAC Official Method，黑木耳膳食纖維的測定結(jié)果見表8。

表8 黑木耳膳食纖維的測定結(jié)果Table 8 The result of the dietary of Auricularia auricula

由表8可知，采用AOAC方法測定出的黑木耳膳食纖維的值低于校正后膳食纖維值，主要是由于AOAC方法中計算膳食纖維含量時，把按凱氏定氮法測定出的含氮量全都計算為蛋白質(zhì)，沒有考慮黑木耳中含有的幾丁質(zhì)中的含氮量。校正后黑木耳膳食纖維的含量與校正前相差3.18%。

3 結(jié)論

本文通過測定甲殼素中氨基糖回收率確定樣品消解成游離氨基糖的最優(yōu)條件。在實驗中嘗試不同的預(yù)處理方法，如煮沸法，但所需時間較長(需十幾個小時)，而微波消解只需幾分鐘，操作方便，且氨基糖回收高，因此酶解前的樣品預(yù)處理方式選用微波消解法。并進(jìn)一步通過正交實驗確定黑木耳膳食纖維測定的微波消解條件為，鹽酸濃度8mol/L、鹽酸用量8mL、消解第一階段功率60W、消解60s，第二階段功率100W、消解120s。

黑木耳中脂肪含量較低(小于3%)，進(jìn)行膳食纖維測定時，不需要石油醚進(jìn)行脫脂處理。由于黑木耳中含量一定量的氨基糖，直接參照AOAC方法測定膳食含量時會造成3.18%的偏差，因此測定時需對AOAC方法進(jìn)行校正。

［1］Valentine A Aletor.Compositional studies on edible tropical species of mushrooms［J］.Food Chemistry，1995，54(3): 265－268.

［2］WuQin，TanZhiping，LiuHaidan，etal.Chemical characterization ofAuricularia auriculapolysaccharides and its pharmacological effect on heart antioxidant enzyme activities and left ventricular function in aged mice［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，46:284－288.

［3］Peter CK Cheung.Dietary fibre content and composition of some edible fungi determined by two methods of analysis［J］.J Sci Food Agric，1997，73:255－260.

［4］McCleary B V，Bouhet F，Driguez H.Measurement of aminoglucoside using p－nitrophenyl b－maltoside as substrate［J］.Biotechnology Techniques，1991(5):255－258.

Study on the effect of different pretreatment condition to the determination ofauricularia auriculadietary fiber

HE Wei－feng1，CHEN Ping1，LI Chun－yang2，ZHANG Yong－jun1，*，LIN Li－jie1，ZHENG Yang－yang1，WU Jing－dong1
(1.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China;
2.Institute of Processing Agriculture Product，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China)

For the problem of the nitrogen element in the aminoglycoside molecule in the cell wall ofAuricularia auricular，it was not accurate to determine the contents of total dietary fiber ofauricularia auriculasamples by enzyme－weighted method and enzyme－chemical method by AOAC directly，without considering the non－protein nitrogen.The non－protein nitrogen in theauricularia auriculasamples were determined in this paper，and the difference on the determinationauricularia auriculadietary fiber was compared between AOAC official method 991.43 and its correction method.Firstly，the optimum condition to determine the recovery of aminoglycoside in chitin was gained，first stage was 60W and 60s，and second stage was 100W and 120s，upon the condition of 8mol/L and 8mL HCl at microwave digestion method.The result showed that there would be 3.18%deviation with AOAC official method 991.43 directly，and the correction to AOAC official method was necessary at the determination of edible fungi dietary fiber with chitin.

Auricularia auricular;dietary fiber;pretreatment;detection

TS207.3

A

1002－0306(2012)21－0305－04

2011－12－26 *通訊聯(lián)系人

何偉峰(1990－)，男，本科生，研究方向:食品檢測。

浙江省自然科學(xué)基金項目(Y3100539);浙江省科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2010R50028);浙江省食品質(zhì)量安全與檢測實驗教學(xué)中心項目;浙江省大學(xué)生創(chuàng)新活動計劃(新苗人才計劃，2012R409048)。