張佳寧，宋云花，王 玥，鄒小雨，于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的研究

張佳寧，宋云花，王 玥，鄒小雨，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

采用海藻酸鈉－殼聚糖作為載體對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定，以固定化酶的活力回收率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)固定化條件為:海藻酸鈉濃度2.0%，殼聚糖濃度2.0%，鈣離子濃度0.25mol/L，戊二醛質(zhì)量百分濃度0.3%，交聯(lián)時(shí)間7h，此時(shí)固定化酶活力回收率達(dá)到74.8%;對(duì)固定化酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，其最適溫度為55℃，最適pH為5.0。該固定化酶重復(fù)使用7次后活力可以保持54%以上。掃描電子顯微鏡(SEM)結(jié)果也顯示海藻酸鈉－殼聚糖能較好的固定磷脂酶A2。

海藻酸鈉－殼聚糖，磷脂酶A2，固定化，SEM

磷脂酶A2(PLA2)是一類(lèi)能夠在磷脂甘油部分的Sn－2位點(diǎn)選擇性斷裂酯鍵的酶［1］，其可將磷脂水解成一系列生物活性介質(zhì)［2］;由于PLA2酶源來(lái)自豬胰腺，相對(duì)短缺，未推廣開(kāi)。最早將酶法脫膠用于工業(yè)生產(chǎn)的是德國(guó)Lurgi公司，國(guó)內(nèi)也有不少相關(guān)報(bào)道，現(xiàn)今用于脫膠的酶主要是 Novo公司推出的Lecitase 10L、Lecitase Novo［3］和Lecitase Ultra。其中，豬胰臟來(lái)源的磷脂酶Lecitase 10L已不用于油脂脫膠，而被更具優(yōu)勢(shì)的微生物Rohalase MPL所代替［4］。酶的固定化是用一定的材料將活性酶束縛或限制于一定的區(qū)域內(nèi)，但仍能進(jìn)行酶所特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一種新技術(shù)［5］。它具有諸多優(yōu)勢(shì)，如:易于將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)，方便后續(xù)的分離和純化;對(duì)溫度和pH適應(yīng)范圍增大;可以增加產(chǎn)物的收率;酶的使用效率高，使用成本低;適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)［6］等。目前，對(duì)于磷脂酶A2的固定化方法報(bào)道較少，Anders Falk Vikbjerg等曾采用大孔樹(shù)脂對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定化［7］，Juhan Kim等將磷脂酶A2固定于海藻酸鹽－硅酸鹽凝膠并將其應(yīng)用于蛋黃溶血磷脂產(chǎn)品的生產(chǎn)［8］，而將磷脂酶A2固定于海藻酸鈉－殼聚糖載體未見(jiàn)報(bào)道。制備固定化酶的方法主要有吸附、包埋、共價(jià)鍵結(jié)合和交聯(lián)法等，其中包埋法不需要化學(xué)修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應(yīng)條件溫和、很少改變酶分子結(jié)構(gòu)、酶活力損失小等優(yōu)點(diǎn)［9］。海藻酸鈉、殼聚糖是最為常見(jiàn)的包埋材料［10－11］，因此可用其來(lái)作為固定化酶的載體。二價(jià)金屬離子如Ca2+與可溶性海藻酸鈉反應(yīng)生成海藻酸鈣微凝膠［12］，而海藻酸鈉、殼聚糖可與戊二醛基形成Schiff氏堿，在膠囊表面形成一層致密的保護(hù)膜，可增加微膠囊球的強(qiáng)度［13］。本實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉－殼聚糖為包埋材料，戊二醛為交聯(lián)劑，固定化PLA2，最終選擇出最優(yōu)的固定化條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Rohalase MPL(實(shí)測(cè)酶活力:2500u/mL) 德國(guó)AB公司;無(wú)油磷脂 大慶日月星蛋白有限公司;海藻酸鈉(脫乙酰度85%) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;殼聚糖 青島利中甲殼質(zhì)公司;戊二醛(50%)天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、Tris試劑、鹽酸、醋酸 化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

LGJ－1型冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠; DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州金育科貿(mào)有限公司;PHS－3C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司;恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)所選用的磷脂酶A2(Rohalase MPL)采用海藻酸鈉－殼聚糖為基質(zhì)進(jìn)行固定，以海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、鈣離子濃度、戊二醛質(zhì)量百分濃度和交聯(lián)時(shí)間為變量，以酶活回收率為指標(biāo)，對(duì)固定化條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，而后對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn);進(jìn)而對(duì)固定化酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期得到海藻酸鈉－殼聚糖固定化磷脂酶A2的最優(yōu)固定化條件。

1.2.2 固定化磷脂酶A2的方法 稱(chēng)取一定量的海藻酸鈉在40℃水浴中保溫溶解，同時(shí)稱(chēng)取一定量的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40℃水浴中保溫溶解，再向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混勻。用移液槍準(zhǔn)確移取1mL稀釋10倍的酶液于一定濃度的10mL海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻，靜止一段時(shí)間后，用滅菌后的10mL注射器、約5滴/s的速度將其注入一定濃度的10mL殼聚糖醋酸－CaCl2混合溶液中，以轉(zhuǎn)速180r/min攪拌，形成光滑的微膠囊球，再加入一定濃度戊二醛，同時(shí)快速攪拌，將其置于4℃環(huán)境固定化一定時(shí)間。將微膠囊以 pH8.0NaHCO3、0.1mol/L NaCl、0.1mol/L pH5.5 NaAc、pH8.0 Tris－HCl順序洗滌后，進(jìn)行冷凍干燥，備用［14］。

1.2.3 響應(yīng)面法對(duì)固定磷脂酶A2方法的優(yōu)化 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box－benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以殼聚糖濃度(A)、交聯(lián)時(shí)間(B)和氯化鈣濃度(C)為自變量，固定化酶酶活回收率(R1)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。自變量水平編碼見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels

1.2.4 游離酶和固定化酶活力的測(cè)定 取稀釋十倍的磷脂酶3mL，加入27mL 0.35%卵磷脂懸液，在冰浴中混合均勻后分裝于6支50mL的離心管中。三支放在冰浴中15min作為對(duì)照，同時(shí)另外三支在50℃水浴中保溫15min后迅速放于冰浴中，均在冰浴條件下用4.0mmol/L的NaOH滴定，滴定終點(diǎn)以pH計(jì)測(cè)量的pH為7.0終止。記錄空白組、實(shí)驗(yàn)組所消耗的NaOH的體積數(shù)V0、V(mL)，換算成國(guó)際單位(U)，1U為1min水解1μmol卵磷脂所需的酶量。

1.2.5 固定化酶活回收率的計(jì)算方法 酶活回收率(%)=固定化酶活力/固定化前游離酶的活力×100

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂酶A2固定化條件的確定

2.1.1 殼聚糖濃度對(duì)固定化酶活力回收率的影響 取海藻酸鈉濃度為2%，CaCl2溶液濃度為0.25mol/L，戊二醛質(zhì)量百分濃度為0.3%，固定化時(shí)間為6.5h，殼聚糖濃度分別為 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，按1.2.2的方法對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定化，以酶活回收率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 殼聚糖濃度對(duì)磷脂酶固定化的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on activity of immobilized PLA2

如圖1所示，當(dāng)殼聚糖濃度大于2.0%時(shí)，固定化酶活力回收率開(kāi)始下降。這是由于過(guò)大的殼聚糖濃度，使得微膠囊表面的聚電解質(zhì)膜更加致密，造成底物擴(kuò)散困難、固定化酶活力回收降低，而且殼聚糖濃度過(guò)高形成的膠囊不易洗滌分離。因此，殼聚糖濃度選擇在2.0%。

2.1.2 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活力回收率的影響取殼聚糖濃度為2%，CaCl2溶液濃度為0.25mol/L，戊二醛質(zhì)量百分濃度為0.3%，海藻酸鈉濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，固定化時(shí)間為6.5h，按1.2.2的方法對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定化，以酶活回收率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 海藻酸鈉濃度對(duì)磷脂酶固定化的影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentration on activity of immobilized PLA2

由圖2可看出，海藻酸鈉的濃度為2.0%時(shí)，酶活回收率最高。這是因?yàn)楫?dāng)海藻酸鈉的濃度過(guò)大時(shí)，其黏性也就越大，所形成的小球有拖尾現(xiàn)象，且此時(shí)所形成的凝膠孔徑較小，影響了酶與底物的結(jié)合;反之，若海藻酸鈉濃度太小，所形成的小球呈扁球狀，此時(shí)凝膠的孔徑較大，固定化酶容易流失，所以酶活較低。因此，合適的海藻酸鈉濃度成球難易適中，且易形成酶活較高、強(qiáng)度適中的小球。

2.1.3 鈣離子濃度對(duì)固定化酶活力回收率的影響取殼聚糖、海藻酸鈉濃度分別為2%，戊二醛質(zhì)量百分濃度為0.3%，固定化時(shí)間為6.5h，氯化鈣濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35mol/L，按1.2.2的方法對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定化，以酶活回收率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 鈣離子濃度對(duì)磷脂酶固定化的影響Fig.3 Effect of calcium ion concentration on activity of immobilized PLA2

由圖3可看出，氯化鈣的濃度為0.25mol/L時(shí)，酶活回收率最高。這是因?yàn)楫?dāng)鈣離子濃度較低時(shí)，所形成的凝膠強(qiáng)度較差，包埋不完全，包埋在內(nèi)部的酶容易流失。而鈣離子濃度較大時(shí)，過(guò)多的鈣離子附著于凝膠表面，鈣離子與酶作用，導(dǎo)致酶活力降低。

2.1.4 戊二醛質(zhì)量百分濃度對(duì)固定化酶活力回收率的影響 取殼聚糖、海藻酸鈉濃度分別為2%，氯化鈣濃度為0.25mol/L，固定化時(shí)間為6.5h，戊二醛質(zhì)量百分濃度分別為0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，按1.2.2的方法對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定化，以酶活回收率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 戊二醛濃度對(duì)磷脂酶固定化的影響Fig.4 Effect of glutaraldehude concentration on activity of immobilized PLA2

由圖4可看出，戊二醛的質(zhì)量百分濃度為0.3%時(shí)，酶活回收率最高。這是因?yàn)槲於┦且环N雙官能團(tuán)試劑，可以和載體上的氨基進(jìn)行Schiff反應(yīng)，再與酶發(fā)生Schiff反應(yīng)。從圖4結(jié)果可知，當(dāng)戊二醛濃度低于0.3%時(shí)，相對(duì)酶活隨戊二醛濃度的增加而增大，此時(shí)，戊二醛、磷脂酶A2和海藻酸鈉－殼聚糖發(fā)生了強(qiáng)烈的交聯(lián)反應(yīng)，隨著戊二醛濃度的增大微膠囊的強(qiáng)度也逐漸增大;隨著戊二醛濃度進(jìn)一步增加，由于酶分子活性基團(tuán)被戊二醛過(guò)多的修飾，酶活回收率也開(kāi)始慢慢下降。因此，確定最適戊二醛質(zhì)量百分濃度為0.3%。

2.1.5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響 取殼聚糖、海藻酸鈉濃度分別為2%，氯化鈣濃度為0.25mol/L，固定化時(shí)間為6.5h，戊二醛質(zhì)量百分濃度0.3%，交聯(lián)時(shí)間分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5h，按

1.2.2的方法對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行固定化，以酶活回收率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)磷脂酶固定化的影響Fig.5 Effect of the time of cross－linking on PLA2immobilization

由圖5可知，固定化開(kāi)始時(shí)，由于海藻酸鈉－殼聚糖包埋逐漸緊密，酶的流失減少，固定化酶的活力回收率呈升高趨勢(shì);6.5h時(shí)固定化酶活達(dá)到最大，再延長(zhǎng)時(shí)間只會(huì)使Ca2+與酶作用，酶活降低，因此選用6.5h為最佳固定化時(shí)間。

2.1.6 磷脂酶A2固定化最佳條件的確定 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box－benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以殼聚糖濃度(A)、交聯(lián)時(shí)間(B)和氯化鈣濃度(C)為自變量，固定化酶酶活回收率(R1)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design proposal and experiment result of response surface

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3(p值＜0.05為顯著項(xiàng))。

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到酶活回收率(R1)對(duì)殼聚糖濃度(A)、交聯(lián)時(shí)間(B)和氯化鈣濃度(C)的回歸方程為:R1=75.05+1.2A+1.97B +0.36C－1.37AB－0.39AC+0.41BC－3.08A2－3.41B2－3.63C2。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The test results of variance analysis

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(p＜0.0001)失擬項(xiàng)不顯著(p＞0.05)，并且該模型 R2=98.35%，R= 96.23%，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好。圖6～圖8分別給出了殼聚糖濃度、交聯(lián)時(shí)間和氯化鈣濃度的交互作用對(duì)固定化酶酶活回收率的響應(yīng)曲面圖。

由圖6可以看出，酶活回收率的極值出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，在殼聚糖濃度為1.9%～2.1%，交聯(lián)時(shí)間約為時(shí)6.5h，酶活回收率在74%以上。

圖6 殼聚糖濃度和交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活回收率影響的響應(yīng)面Fig.6 Influence of chitosan concentration and the time of cross－linking on the enzyme activity recovery

由圖7可以看出，酶活回收率的極值出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，在殼聚糖濃度為1.9%～2.1%，鈣離子濃度約為0.25mol/L時(shí)，酶活回收率在74%以上。

從圖8看出，酶活回收率的極值出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，在交聯(lián)時(shí)間為6.4～6.6h之間，鈣離子濃度約為0.25mol/L時(shí)，酶活回收率在74%以上。

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，按照表4整理值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的酶活回收率為74.8%。預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。

圖7 鈣離子濃度和殼聚糖濃度對(duì)酶活回收率的影響Fig.7 Influence of calcium ion and chitosan concentration on the enzyme activity recovery

圖8 鈣離子濃度和交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響Fig.8 Influence of calcium ion concentration and the time of cross－linking on the enzyme activity recovery

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果Table 4 Results of response surface optimization

2.2 固定化酶的性質(zhì)研究

2.2.1 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性比較 取一定量的固定化酶和游離酶，分別于35、40、45、50、55、60℃下測(cè)定游離酶和固定化酶酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 溫度對(duì)固定化酶相對(duì)酶活力的影響Fig.9 Effect of temperature on relative activity of immobilized lipase and free lipase

由圖9可以看到，當(dāng)溫度在45℃時(shí)，游離酶達(dá)到最適溫度，而固定化酶的最適溫度為55℃，表明固定化后的酶耐熱性有所提高，更加適應(yīng)苛刻的條件。

2.2.2 pH對(duì)固定化酶和游離酶酶活力的影響 取一定量的固定化酶和游離酶，分別在pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的活力，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 pH對(duì)固定化酶相對(duì)酶活力的影響Fig.10 Effect of pH on relative activity of immobilized lipase and free lipase

由圖10可以看到，當(dāng)pH為4.0時(shí)，游離酶達(dá)到最適pH，而固定化酶的最適pH為5.0，表明固定化后酶的pH適應(yīng)范圍更加寬泛。

2.2.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性 游離酶無(wú)法從反應(yīng)體系中分離，因此不能重復(fù)利用。而固定化酶則可以從反應(yīng)體系中分離，可以重復(fù)使用。以5%粉末無(wú)油磷脂為底物，進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別在相同條件下連續(xù)進(jìn)行7批次操作，測(cè)定其酶活力。以第一批次樣品測(cè)得活力為100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。

圖11 重復(fù)使用次數(shù)對(duì)固定化酶相對(duì)酶活力的影響Fig.11 Effect of repeated use frequency on relative activity of immobilized lipase

由圖11結(jié)果可知，重復(fù)7次以后，酶活力降為原來(lái)的54.3%，相對(duì)活力的下降可能是由于在不斷攪拌的作用下，海藻酸鈉－殼聚糖載體持水性發(fā)生變化，固定化酶凝膠結(jié)構(gòu)的改變和酶的泄漏損失所造成的結(jié)果。

2.2.4 海藻酸鈉－殼聚糖固定化磷脂酶A2微膠囊的SEM 圖12中a、b分別為海藻酸鈉－殼聚糖包埋的微膠囊冷凍干燥后顆粒的掃描電鏡(SEM)圖片。從圖中可以看出，海藻酸鈉－殼聚糖形成球形凝膠狀結(jié)構(gòu)，由于形成的球狀結(jié)構(gòu)較其他形狀具有更大的表面積，因而保證了固定化酶在使用過(guò)程中可以充分的與物料接觸，進(jìn)而提高反應(yīng)速率;此外，由于制作過(guò)程采用了冷凍干燥技術(shù)，使得固定化酶顆粒內(nèi)部的水分直接由冰升華，內(nèi)部形成了許多褶皺結(jié)構(gòu)，這些褶皺可以有效地?cái)r截、包埋磷脂酶A2，有效地提高了包埋效率，同時(shí)，減小底物和產(chǎn)物在微膠囊內(nèi)部的擴(kuò)散阻力，提高反應(yīng)速度;此外，對(duì)固定化后的磷脂酶A2作出酶活力檢測(cè)，可以確定出固定化的效果，進(jìn)一步驗(yàn)證了海藻酸鈉－殼聚糖能較好的固定化磷脂酶A2。

圖12 SEM圖像Fig.12 SEM images

3 結(jié)論

研究表明:以海藻酸鈉－殼聚糖作為載體包埋磷脂酶A2的固定化方法，具有很好的固定化效果。得到了最佳的固定化條件為:海藻酸鈉濃度為2.0%，殼聚糖濃度為2.0%，鈣離子濃度為0.25mol/L，戊二醛質(zhì)量百分濃度為0.3%，交聯(lián)時(shí)間為7h。該固定化酶的最適溫度為55℃，比游離酶升高了10℃;最適pH為5.0，與游離酶相比pH向堿性偏移1.0，固定化酶活力回收率為74.8%;經(jīng)7次重復(fù)使用后，酶活力降為原來(lái)的54.3%，說(shuō)明固定化酶的穩(wěn)定性較好。

SEM結(jié)果顯示:海藻酸鈉－殼聚糖包埋的微膠囊內(nèi)部形成了許多空隙結(jié)構(gòu)，這些空隙可以有效地?cái)r截、包埋脂酶A2，有效地提高了包埋效率，同時(shí)，在一定程度上增加了酶促反應(yīng)的機(jī)會(huì)并提高反應(yīng)的效率。

本文以海藻酸鈉－殼聚糖為載體制備固定化磷脂酶A2，具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和及操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，固定化酶的穩(wěn)定性較好，制備的固定化酶可多次再生，重復(fù)使用7次，酶活力回收仍可達(dá)54%以上。

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Study on phospholipase A2immobilized by sodium alginate－chitosan

ZHANG Jia-ning，SONG Yun-hua，WANG Yue，ZOU Xiao-yu，YU Dian-yu*
(Food Science College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China)

The phospholipase A2was immobilized on the sodium alginate－chitosan supporter.The single－factor tests of immobilized condition were made through investigating the ratio of enzyme activity recovery，and then the results were selected by the response surface methodology.The optimal condition of the immobilized:the concentration of sodium alginate and chitosan were both 2.0%，calcium ion concentration was 0.25mol/L，glutaraldehude concentration was 0.3%，the time of cross－linking was 7h，with these conditions，the ratio of immobilized enzyme activity recovery was 74.8%.The immobilized PLA2characterization:the optimal temperature for the immobilized PLA2was 55℃，the optimal pH was 5.0，and after seven times repeated reaction，the relative activity of immobilizaed phospholipase was greater than 54%.The result of SEM images showed that sodium alginate－chitosan supporter could better immobilized PLA2.

sodium alginate－chitosan;phospholipase A2;immobilized;SEM

TS221

B

1002－0306(2012)21－0201－06

2012－04－24 *通訊聯(lián)系人

張佳寧(1988－)，女，在讀碩士，研究方向:糧食油脂及植物蛋白。

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2010GB2B200134);國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD02B01)。